一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，该基因具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。上述基因编码的I型液泡膜焦磷酸酶具有如SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本发明专利技术还公开了一种上述来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因及其对应编码的氨基酸，此外本专利技术也涉及到这些基因的克隆方法。
技术介绍
矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科(Leguminosae)、黄华族(Thermopsideae)、沙冬青属(Ammopiptanthus Chengf.)，为第三纪孑遗植物，被列为国家二级濒危保护植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石质戈壁类型的内蒙古西部和宁夏、甘肃、矮的部分沙漠、荒漠地带，是该区唯一的常绿阔叶灌木，分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6.8°C，气温变化极值可达70°C以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70°C左右的地表沙温和低至零下20°C 30°C的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青抗旱耐冻的特性，因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于矮沙冬青的????????????????????????????????????????????????型液泡膜焦磷酸酶基因，该基因具有如SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列。2013101002353100001dest_path_image001.jpg

【技术特征摘要】
2012.05.15 CN 201210148680.21.一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，该基因具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于:该基因的所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。3.依照权利要求1所述的一种来源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤: (1)总RNA的提取和纯化: 采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA。(2)中间片段的克隆: A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，以含有接头的3’ RACE Adaptor引物进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。 B、PCR扩增 以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物jf3和下游引物jx3，进行PCR扩增。扩增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。 (3)3，端的克隆: C、3，-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP3-3’-outer和3’端下游引物3’ -RACE outer,进行3’端outer PCR扩增: 扩增得到的产物为cDNA 3’端。 D、3，-1nnerPCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP3-3’-1nner，以前述步骤C所得3’端的outer PCR产物为模板，利用特异性上游引物GSP3_3’-1nner和3’端下游引物3’ -RACE inner，进行3’端inner PCR扩增: 扩增得到的产物为cDNA 3’端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3’端完整序列。(4)5’端的克隆: E、合成5’端的cDNA第一链: 以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，对RNA进行预处理，加入含有接头的5’ RACE Adapter引物进行反转录: 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链。 F、5，-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’-outer和5，端上游引物5，-RACE outer，进行5，端outer PCR扩增:扩增得到的产物为cDNA 5’端。 G、5，-1nner PCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP3-5’ -1nner,以前述步骤F所得5’端的outer PCR产物为模板，利用特异性下游引物GSP3-5’ -1nner和5’端上游引物5’ -RACE inner，进行5’端inner PCR扩增: 扩增得到的产物为cDNA 5’端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5’端完整序列。(5)cDNA全长序列拼接和克隆 将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得3’端inner PCR扩增序列和步骤(4)所得5’端inner PCR扩增序列进行完整序列的拼接，得到完整的基因序列。(6)I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆: 将上述步骤(4)合成5’端的cDNA第一链作为模板，根据上述步骤(5)的基因分析设计上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并进行PCR扩增: 扩增得到的产物为完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(I)中，采用的RNA提取方法为试剂盒法；纯化方法为DNA酶消化法。5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(2)中进行PCR扩增时， 扩增体系为: TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板2 μ L ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晚忱，雍太明，付凤玲，刘艳萍，于好强，邓龙群，佘跃辉，周树峰，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：