一种来源于新疆沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶的基因序列及其克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种来源于新疆沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶的基因序列，该基因具有如SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列。上述基因编码的钼辅助因子硫酸化酶具有如SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本发明专利技术还公开了一种上述来源于新疆沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶基因序列的克隆方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因及其对应编码的氨基酸，此外本专利技术也涉及到该基因的克隆方法。
技术介绍
新疆沙冬青新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名矮沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科(Leguminosae)、黄华族(Thermopsideae)、沙冬青属(Ammopiptanthus Cheng f.),为第三纪孔遗植物,被列为国家一级保护植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石质戈壁类型的内蒙古西部和宁夏、甘肃、新疆的部分沙漠、荒漠地带，是该区唯一的常绿阔叶灌木，分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6. 8°C，气温变化极值可达70°C以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70°C左右的地表沙温和低至零下20°C 30°C的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。钥辅助因子硫酸化酶是脱落酸生物合成过程中的关建酶。被硫酸化后的钥辅助因子是植物脱落酸生物合成途径中参与最后一步反应的脱落酸醛氧化酶所必需的辅助因子，因此能够调节脱落酸介导的植物寒冷和渗透逆境反应的相关基因表达。新疆沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因对基础和应用研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对荒漠抗逆植物新疆沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良抗逆性能。本专利技术的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列，该序列具有如SEQ IDNO. I所述的核苷酸序列以及该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到(I)总RNA的提取和纯化可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取得到纯化的新疆沙冬青叶片总RNA;常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于新疆沙冬青叶片总RNA的提取；本专利技术中可优选试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA.2. O提取试剂盒，CAT#90404-50)，进行新疆沙冬青叶片总RNA提取。纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的新疆沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本专利技术中可优选DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2. O提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。(2)中间片段的克隆A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(I)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code D314)试剂盒中 3' RACE Adaptor 进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板；B、PCR 扩增以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述兼并上游引物(jfl)和兼并下游引物(jxl)，进行PCR扩增。钥辅助因子硫酸化酶基因中间片段扩增兼并引物jfl 5/ -GTCGGAGAGRCKTTTCCRTGG-3'，jxl 5/ -TGCACAWGCDCCWGGATTR-3'；扩增得到新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。本步骤中，扩增体系可优选为TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(jxl/jfl)luL,ddH2016 μ L。扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95°C，30s，60°C，30s，72°C，50s(35 个循环)；72°C，8min ;4°C 保温。(3)3'端的克隆C、3' -outer PCR 扩增根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3' -outer,以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP1-3' -outer 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE outer,进行3'端outer PCR扩增:钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游outer引物GSPl-3/ -outer 5/ -GCATGGCGATGGATCTAGCATGTGCAT-3'；3'端下游引物 3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；扩增得到的产物为cDNA 3'端；本步骤中，扩增体系可优选为IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP1-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 个循环)72°C, 8min ；4°C 保温。D、3' -inner PCR 扩增根据前述步骤⑵所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSPl-Si-inner，以前述步骤C所得:V端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP1-3'-inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE inner,进行3'端inner PCR扩增钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游inner引物GSP1-3' -inner 5/ -GGCTCTTGGTATGGATACCGTGAAGTGG-3'；3'端下游引物 3' -RACE inner 3' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'；扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列；本步骤中，扩增体系可优选为dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,31 -outer PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列，该基因具有如SEQ IDNO. I所述的核苷酸序列。2.根据权利要求I所述的序列，其特征在于该基因所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。3.依照权利要求I所述的一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤 (1)总RNA的提取和纯化 采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取得到纯化的新疆沙冬青叶片总RNA ； (2)中间片段的克隆 A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(I)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3' -FullRACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中 3' RACE Adaptor 进行反转录，得到的 cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板； B、PCR扩增 以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物(jfl)和下游引物(jxl)，进行PCR扩增。钥辅助因子硫酸化酶基因中间片段扩增引物 jfl 5/ -GTCGGAGAG RCKTTTCCRTGG-3'， jxl 5/ -TGCACAWGCDCCWGGATTR-3'； 扩增得到新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。(3)3'端的克隆 C、3'-outer PCR 扩增 根据上述步骤⑵得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3' -outer，以前述步骤(2) A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP1-3' -outer 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE outer,进行3'端outer PCR扩增: 钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游outer引物GSP1-3' -outer 5/ -GCATGGCGATGGATCTAGCATGTGCAT-3'； 3'端下游引物3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'； 扩增得到的产物为cDNA 3'端； D、3'-inner PCR 扩增 根据前述步骤⑵所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSPl-Si -inner，以前述步骤C所得:V端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP1-3' -inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE inner,进行3'端inner PCR扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游inner引物GSP1-3' -inner :5' -GGCTCTTGGTATGGATACCGTGAAGTGG-3'； 3'端下游引物3' -RACE inner 3' -RACE inner 5; -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'； 扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列； (4)5'端的克隆 E、合成5'端的cDNA第一链 以上述步骤⑴纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU# :AMl700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 5 ' RACE Adapter 后，以RandomDecamers进行反转录5' RACE Adapter 5/ -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3,；合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链； F、5'-outer PCR 扩增 根据上述步骤⑵得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5' -outer,以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物 GSP1-5' -outer 和 FirstChoiceeRLM-RACE Kit 试剂盒中的 5'端上游引物 5' -RACEouter,进行 5'端 outer PCR 扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因5'端的特异性下游outer引物GSPl-5/ -outer 5/ -TTCACCAAGTCAAGGCCAAATCTC-3'； 5'端上游引物5' -RACE outer 5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'； 扩增得到的产物为cDNA 5'端； G、5'-inner PCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5' -inner,以前述步骤F所得Y端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP1-5' -inner和FirstChoice RLM-RACE Kit 试剂盒中 Y 端上游引物 Y -RACE inner，进行 Y 端 inner PCR扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因5'端的特异性下游inner引物GSP1-5' -inner 5/ -CATCACCTGTTGGCTCTCCCTC-3'； 5'端上游引物5' -RACE inner 5' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'； 扩增得到的产...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晚忱，雍太明，付凤玲，刘艳萍，于好强，邓龙群，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：