本发明专利技术公开了一种酿酒酵母的6-磷酸海藻糖合成酶tps1基因及其酵母表达载体，将6-磷酸海藻糖合成酶tps1基因酵母表达载体应用在酿酒酵母内，来增加细胞内海藻糖的积累从而提高其乙醇耐受性，通过蒽酮-硫酸法测定细胞内海藻糖的含量，实验证明本发明专利技术提供的6-磷酸海藻糖合成酶基因表达载体转化到酿酒酵母中后酵母细胞中6-磷酸海藻糖合成酶酶活性提高，6-磷酸海藻糖合成酶酶活性的提高增加了酵母细胞的乙醇耐受性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及和酿酒酵母乙醇耐受性有关的6-磷酸海藻糖合成酶基因及其酵母表达载体，以及运用该表达载体增加酿酒酵母细胞内海藻糖的积累和细胞的乙醇耐受性。
技术介绍
酿酒酵母是工业发酵的常用菌株，在生产中酿酒酵母经常面临非常多的压力，例如高温、高渗透压、高乙醇胁迫、营养物质缺乏等。在这些胁迫下可以生存并高产乙醇的酵母对于工业生产是非常重要的。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过a-a-1-l键连接而成的非还原性二糖。海藻糖与微生物细胞一系列耐受性机制有关，并且在酵母细胞中扮演着储存碳源的角色。研究表明海藻糖具有稳定蛋白、抑制变性蛋白的聚集、保护细胞膜的功倉泛Jain, N.K.and 1.Roy (2009).Effect of trehalose on protein struc-ture.Protein Sc1.18: 24-36.，同时编码海藻糖合成酶的基因在多种胁迫条件下其表达量增力口Li, L., Y.Ye, L.Pan, Y.Zhu, S.Zheng, and Y.Lin (2009).The inductionof trehalose and glycerol in Saccharomyces cerevisiae in response to variousstresses.Biochem.Biophysic.Res.Com-munic.387: 778-783.。酿酒酵母的海藻糖合成由两步完成戴秀玉，程萍，周坚，江慧修(1995).海藻糖的生理功能、分子生物学研究及应用前景.微生物学通报.22 (2)，首先UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖合成酶的作用下生成6-磷酸海藻糖，在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶的作用下形成海藻糖。在酿酒酵母中，上述海藻糖合成相关酶可以形成多酶复合体，包括4种蛋白TPS1，TPS2，TSLl 和 TPS3。Xianglin Tao 等人发现在用 10% 乙醇刺激 5: cerevisiae Z5 和S.cerevisiaeSZ3-1时,与海藻糖合成有关`的基因tpsl，tps2, i/75.J和tsll表达水平都有所提高。研究表明乙醇压力可以同时诱导编码海藻糖合成酶和降解酶基因的表达，来帮助酵母菌调节细胞内海藻糖含量抵御外界乙醇压力Tao X，Zheng D, Liu T, Wang P, Zhaoff, et al.(2012) A Novel Strategy to Construct Yeast Saccharomyces cerevisiaeStrains for Very High Gravity Fermentation.PLoS ONE 7(2): e31235.do1:10.1371/ journal, pone.0031235。在乙醇胁迫条件下海藻糖的功能可能是通过化学分子伴侣的形式，来防止蛋白质的错误折叠。和其他的糖相比，海藻糖可以更有效的防止蛋白质的变性和聚集，因为它具有改变蛋白质周围水环境的特殊能力。高浓度海藻糖的积累可以替代水分子，在海藻糖的羟基集团和细胞膜脂类极性集团之间形成氢键使细胞膜蛋白更加稳定。本专利技术选择克隆SaccAaro焊Ce1S cererisiae s288c的基因，构建表达载体转化Saccharomyces cererisiaeINVSc进行表达并证明其对酵母细胞内海藻糖含量和乙醇耐受性的影响，有望在工业生产中应用提高酵母的乙醇产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酿酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不,本专利技术的基因来源于SaccAan謂Fees cererisiae s288c。本专利技术的另一目的是提供6-磷酸海藻糖合成酶基因tpsl的酵母表达载体ρΥΕ53- /Λ57，该表达载体含有tpsl基因，tpsl基因上游含有半乳糖启动子。本专利技术的另一目的是将酿酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因的表达载体应用在提高酿酒酵母的乙醇耐受性中，将表达载体ρΥΕ53-φ.57导入酿酒酵母细胞内，通过测量酵母细胞内海藻糖积累的变化来研究海藻糖-6-磷酸合成酶活性是否提高，以及对酵母乙醇耐受性的影响。为了实现本专利技术的上述目的，本发现提供了下述技术方案: 1、酿酒酵母cererisiae s288c (购买于上海北诺生物科技有限公司)的tpsl基因及其序列的获得 (1)根据焊Ce1Scererisiae s288c的tpsl基因已知两端序列和酿酒酵母表达载体PYES3/CT的多克隆酶切位点，设计I对特异引物如下:tpsl-￥: 5，-OTAAGCTTGATGACTACGGATAACGCTAAG-3，tpsl-R:3^ -07gCTCGAGTCAGTTTTTGGTGGCAGAGGA-3， 在上下游引物的5’端和3’分别加入内切酶历和通oJ酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基)，提取焊cm cererisiae s288c的基因组DNA，并以基因组DNA为模板利用上述引物PCR扩增目的基因； (2)胶回收目的基因2、tpsl基因的TA克隆及构建酵母表达载体ρΥΕ53- /Λ57 使用PMD19-T载体进行TA克隆，与16°C过夜连接，转化感受态细胞大肠杆菌DH5a，用内切酶历和XhoI酶进行双酶切验证和PCR验证后，送去测序公司进行测序； 使用内切酶历和沿oJ酶对pYES3和测序正确ρΜ019- /Λ57载体进行双酶切，分别获得5’和3’末端分别带有内切酶和通oJ酶切位点的tpsl基因和pYES3载体大片段，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h，获得酵母表达载体pYES3-φ.57，进行测序比对分析。3、tpsl基因的表达 制备酿酒酵母菌株的感受态细胞，使用电转化法将表达载体转化进酿酒酵母中，使用酵母缺陷型培养基SC/Trp选择性培养基筛选酵母转化子,在以半乳糖为碳源的培养基中诱导基因表达。4、海藻糖标准曲线的制备及提取酵母中海藻糖的方法 利用蒽酮-硫酸法测定不同浓度梯度海藻糖下OD59tl的吸光度来制备标准曲线，用三氯乙酸多次浸提法来提取酵母中的海藻糖。5、测定酵母细胞中海藻糖的含量来证明tpsl基因酶活提高利用蒽酮-硫酸法测定酵母细胞中海藻糖的含量，来证明tpsl基因酶活提高。6、研究tpsl基因的过表达对酿酒酵母乙醇耐受性的影响 本专利技术中克隆的基因是首次从焊cererisiae s288c中克隆得到的，并在酿酒酵母菌中(如cererisiae INVSc)表达,使突变株比野生型菌株可以耐受更高的乙醇浓度，为增加酿酒酵母菌株的乙醇耐受性及提高工业生产时的乙醇产量奠定了分子基础。附图说明图1为本专利技术酿酒酵母cererisiae s288c总基因组DNA电泳不意图，其中:泳道I是IKb plus DNA ladder MarkerI,泳道2、3、4是基因组DNA ； 图2为本专利技术tpsl基因扩增产物电泳示意图，其中:1是DL2，OOODNA MarkerMarkerll，泳道2是水对照，泳道3、4、5是tpsl基因扩增产物； 图3为本专利技术tpsl基因PCR产物胶回收示意图，其中:1是DL2，OOODNA Mark本文档来自技高网...
【技术保护点】
酿酒酵母6?磷酸海藻糖合成酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.酿酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。2.权利要求1所述酿酒酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因的表达载体，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊日布斯，刘石雪，尚淑梅，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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