本发明专利技术涉及一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下：（1）PCR扩增psbA2启动子、花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatB1；（2）经融合PCR，Promotor+AhFatA和Promotor+AhFatB1；（3）经融合PCR扩增，制得Promotor+AhFatA+AhFatB1；（4）插入质粒中，制得重组载体；（5）经转化制得转基因集胞藻；（6）在30℃条件下培养，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。本发明专利技术所述方法获得的转基因集胞藻在30℃混养条件下转AhFatA基因阳性集胞藻PCC6803的亚油酸含量明显增加，具有广阔应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，属于植物基因工程
技术介绍
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。是构成高等动、植物细胞的重要成分之一，对人体具有重要的生理功能。在营养学和医学领域有着重要作 用。目前市场上的多不饱和脂肪酸的主要来源是深海鱼类，但从鱼体内提取的PUFA具有较重的鱼腥味，且鱼油资源有限，价格昂贵，存在潜在的污染问题及因过度捕杀致使全球鱼类数量下降，影响海洋生物的多样化并造成沿岸生态系统的破坏，进而影响生态可持续发展。蓝藻(cyanobacteria)是一类能进行光合作用的原核生物，蓝藻细胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803 (Synechocystis sp. strainPCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。野生型集胞藻PCC 6803中亚油酸(LA)占54. 5%，Y-亚麻酸(GLA)占27. 3%，这为通过转化外源脂肪酸脱饱和酶基因进而增加集胞藻PCC 6803中多不饱和脂肪酸含量的研究提供了基础。植物中脂酰-酰基载体蛋白硫脂酶(Acyl-Acyl Carrier Proteinthioesterases, FAT)是游离脂肪酸合成的关键酶,能催化Acyl-ACPs脱去ACP,产生游离脂肪酸。对于植物脂肪酸的链长和饱和性有重要作用。植物Fat按其序列高同源性和底物偏好主要分为FatA和FatBl两个基因家族，不同FAT对底物的选择不同，这种底物的特异性直接导致了植物油脂储存在组成上和数量上的差异。其中FatA基因家族的酶主要对油酰-ACP( 18:1-ACP)有活性，决定着植物体内18:1输出到质体外的水平。在大多数植物中，FatBl基因家族主要倾向于生成饱和的acyl-ACP脂酰碳链，如对棕桐酰-ACP (16:0-ACP)、硬脂酰-ACP (18:0-ACP)有活性，单非饱和的油酰-ACP (18:1-ACP)也有少量的活性。目前已从向日葵(Helianthusannuus)、油菜(Brassica napus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)> 蓖麻(Ricinus communis)> 山竹(Garcinia mangsotana)、小麦(Triticum aestivum)、葡萄(Vitis vinifera)等多种植物中获得FatA基因片段。FatBl基因也已在在加利福尼亚月桂树(Umbellularia californica)、萼苣花(Cupheahookeriana)、油菜(Brassica napus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、山竹(Garciniamangostana)、玉米(Zea mays )、毛白杨(Populustomentosa)等植物种子中获得，但国内外在目前的现有技术中对硫脂酶基因的研究很少，在花生中虽有硫脂酶基因的克隆，但是还没有硫脂酶基因功能研究的报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法。本专利技术的技术方案如下一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下(I) PCR扩增集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登录号为⑶324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登录号为⑶324447的花生硫脂酶基因AhFatBl ； (2)将步骤(I)获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤(I)制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB I进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+AhFatA 和基因片段 Promotor+AhFatBl ；(3)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl经融合PCR扩增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl ；(4)将步骤(I)获得的psbA20RF基因片段经SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的pBluescriptIISK plus T1T2连接,得到质粒pBluescriptIISK plus TlT2-downstream ；分别对质粒pBluescriptII SK plus TlT2_downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescriptIISK plus TlT2_downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript II SKplusTlT2-npt-downstream ；(5)将步骤(2)制得的基因片段 Promotor+AhFatA、基因片段 Promotor+AhFatBl或者步骤(3 )制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB I插入步骤(4 )制得的质粒pBluescriptll SK plus TlT2-npt_downstream 中，制得重组载体;(6)将步骤(5)制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；(7)将步骤(6)制得的转基因集胞藻在20 30°C条件下通气培养8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。 根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5， -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR扩增花生硫脂酶基因AhFatA的引物为AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；扩增程序如下94°C预变性5min，94°C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下：（1）PCR扩增集胞藻PCC?6803的psbA2启动子基因片段、集胞藻PCC?6803的psbA2ORF基因片段、Genbank登录号为GU324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登录号为GU324447的花生硫脂酶基因AhFatB1；（2）将步骤（1）获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤（1）制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+AhFatA和基因片段Promotor+AhFatB1；（3）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1经融合PCR扩增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1；（4）将步骤（1）获得的psbA2ORF基因片段经SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的pBluescript?II?SK?plus?T1T2连接，得到质粒pBluescript?II?SK?plus?T1T2?downstream；分别对质粒pBluescript?II?SK?plus?T1T2?downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript?II?SK?plus?T1T2?downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript?II?SK?plusT1T2?npt?downstream。（5）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatB1或者步骤（3）制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1插入步骤（4）制得的质粒pBluescriptII?SK?plus?T1T2?npt?downstream中，制得重组载体；（6）将步骤（5）制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；（7）将步骤（6）制得的转基因集胞藻在20～30℃条件下通气培养8～12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。...
【技术特征摘要】
1.一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下 (1)PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2启动子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登录号为⑶324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登录号为⑶324447的花生硫脂酶基因AhFatBl ； (2)将步骤(I)获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤(I)制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB I进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+AhFatA 和基因片段 Promotor+AhFatBl ； (3)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl经融合PCR 扩增，制得基因片段 Promotor+AhFatA+AhFatBl ； (4)将步骤(I)获得的psbA20RF基因片段经SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的 pBluescript II SK plus T1T2 连接，得到质粒 pBluescript II SK plusTlT2-downstream ； 分别对质粒 pBluescript II SK plus TlT2_downstream 和质粒 pUC4K 进行 BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript II SK plus TlT2_downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript II SKplusTlT2-npt-downstream。 (5)将步骤(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl或者步骤(3)制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl插入步骤(4)制得的质粒pBluescriptIISK plus TlT2-npt_downstream 中，制得重组载体； (6)将步骤(5)制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻； (7)将步骤(6)制得的转基因集胞藻在20 30°C条件下通气培养8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为Promotor-F:5’ -GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’ ；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ； 扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C 10min，4°C保存。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，PCR扩增集胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：毕玉平，陈高，何庆芳，张燕，李伟智，边斐，范仲学，单雷，彭振英，马德源，
申请(专利权)人：山东省农业科学院高新技术研究中心，
类型：发明
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