一种抗体人源化改造方法技术

本发明专利技术公开了一种抗体人源化改造方法，包括以下步骤：抗体基因序列分析；抗体Fab的同源建模与优化；表位扫描确定人源化突变位点；虚拟突变与分子动力学模拟，确定关键氨基酸；通过上述分析设计合理的人源化抗体，并再次用表位扫描验证抗体人源化程度；最后在生物实验上对人源化抗体亲和力进行验证。本发明专利技术的有益效果：本方法可以用于鼠源或其他动物源抗体的人源化改造，只需要提供抗体Fab的基因序列，且不依赖于抗原表位的信息，所设计的人源化抗体，具有更高的亲和力保持，更高的人源化程度，可最大程度地解决抗体亲和力与人源化程度之间的矛盾。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学、分子生物学和生物信息学领域，尤其涉及。
技术介绍
单克隆抗体类药物具有特异性强，副作用小，疗效显著等优点，已经成为对抗肿瘤，传染病，自身免疫病等病患的重要工具。目前细胞融合与杂交瘤技术，仍然是最为可靠的制备单克隆抗体的方法，常用来免疫的动物有小鼠，大鼠，羊，兔子及其他动物，其中最常用的是鼠类包括大鼠与小鼠。利用该方法得到的单克隆抗体是动物源的，开发动物源单克隆抗体成为抗体类药物应用于人体，必须要进行人源化改造，以减少异源抗体所引起的人抗动物抗体反应(Human Ant1-Animal Antibodies, HAAA),同时也可以更加有效的激活人体免疫系统，降低抗体类药物的清除速度，并延长半衰期。抗体人源化是一个古老的话题，但因为技术的限制，现有的人源化方法并不能保证100%得到人源化效果好亲和力高的抗体。常见的人源化方法有最早的嵌合抗体，CDR移植(⑶R-grafting)改型抗体、表面重塑人源化抗体及噬菌体展示人源化抗体等，但是大量的实验结果表明现有的这些抗体人源化改造方法成功率有限，比如许多鼠源抗体进行⑶R移植人源化改造后亲和力大大下降，甚至是特异性完全消失。具体地分析原因:这些传统的人源化方法大多数是基于一级结构序列分析或静态的三维分子结构分析进行的，这种分析策略存在主要问题就是无法解决抗体亲和力保持与人源化程度之间的矛 盾，如:人鼠嵌合抗体亲和力保持最好，几乎与亲本鼠源抗体相同，但人源化程度很低，其完全的鼠抗体可变区依然会引起严重的(Human Ant1-MouseAntibody, HAMA)反应；⑶R移植人源化抗体与噬菌体展示人源化抗体被认为是人源化程度最高的抗体，但这两种方法改造的人源化抗体往往亲和力下降严重，甚至是完全消失；表面重塑抗体人源化方法基于抗体分子三维结构分析，相对于CDR移植抗体来讲在亲和力保持上有一定优势，但其抗体内部依然存在大量的鼠源氨基酸，有报道认为也会引起一定的HAMA反应，其亲和力的保持是以牺牲一定人源化程度为代价的。抗体互补决定区(ComplementaryDetermining Regions, CDRs)是在抗体框架区(Framework Regions, FRs)的支持下与抗原分子上的表位氨基酸相互作用的区域。Q)R区与抗原表位精密的分子对接是抗体亲和力与特异性的分子基础，而天然的亲本抗体的CDRs区构象代表了最高的亲和力与最好的抗原结合特异性。理论上FRs区氨基酸的改变，会引起CDRs区构象上发生变化使亲和力下降。有研究证明，在FRs区的所有氨基酸中，大多数的氨基酸的人源化替换对CDRs区构象只产生轻微的影响，不会对抗体亲和力产物严重影响，但也存在着少数几个关键氨基酸，一旦这些关键氨基酸被替换成人的相应氨基酸后，会引起CDRs区构象上很大的改变，进而引起抗体亲和力的严重下降，现有的传统人源化方法正是无法动态地把握这些关键氨基酸，才会使其在人源化实验中往往导致人源化改造之后的抗体亲和力下降或消失。随着现代生物物理学、计算结构生物学的发展，使人们对于生物大分子的结构，功能及抗原抗体分子相互作用的认识更加透彻:利用同源建模(Homology Modeling)技术人们可以了解抗体分子及抗原分子的结构；利用分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟技术，还可以掌握生物大分子的结构与功能之间的动态关系。将上述技术综合起来，再与生物信息学及生物学实验相结合，使解决传统人源化方法存在的问题提供了可能性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，在参考多模板进行CDR移植的基础上，以生物信息学中的表位扫描(Epitope Scaning,ES)技术和计算结构生物学中的虚拟突变与分子动力学模拟为核心，来进行合理的抗体人源化设计。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现: ，包括以下步骤: 抗体基因序列分析，包括以下步骤: O抗体基因克隆:将动物源的分泌特异性抗体杂交瘤细胞提取总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；根据不同动物源不同抗体亚型可变区设计特异性引物，以cDNA为模板，进行抗体基因PCR扩 增，纯化后的PCR产物与克隆载体相连接，连接产物转化感受态细菌，在过夜生长的平板上轻链重链各挑取白色单菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆进行序列测定； 2)抗体序列分析 测定的Fab抗体基因序列可变区VL与VH利用MGT/V-Quest在线服务器分析抗体亚型，并翻译成氨基酸序列，然后综合Kabat、Chothia及IMGT三种抗体⑶Rs区的Numbering方案，以最大程度地保持CDRs区氨基酸为原则，确定抗体轻链与重链的六个CDRs区序列； 2.抗体Fab的同源建模与优化，包括以下步骤: 1)抗体Fab初始结构建模:利用同源建模技术来构建动物源亲本抗体Fab及其嵌合人源化抗体Fab的空间结构，同源建模的过程包括模板搜索、初始结构建模、Loop区的构象搜索及初始模型的MD优化；嵌合抗体模型的构建:利用分子建模工具将动物源抗体可变区与人IgGl抗体的恒定区进行连接构建嵌合抗体的分子模型； 2)抗体Fab的结构优化:对于亲本抗体Fab与嵌合抗体Fab初始模型采用显性溶剂水环境下的能量最小化与IOns的分子动力学平衡模拟来进行全面的优化，从平衡的动力学轨迹中提取稳定的平均构象； 3.表位扫描，确定突变氨基酸位点，包括以下步骤: O人同源序列的搜索:将抗体可变区VL及VH的氨基酸序列作为探针分别利用NCBI_Balstp工具在Genbank上进行序列搜索与VL及VH相似性最高的所有抗体序列，排除所有的非人源和人源化的同源序列并手动去除不完整或者有错误的序列，下载与VL及VH同源性最高的前50条人源抗体完整序列，作为CDR移植的参考模板，将抗体可变区VL与VH的氨基酸序列分别与下载的人同源序列采用动态规划算法进行多重序列比对； 2)表位扫描为了排除来自多个模板比对后进行人源化替换，导致人源化后的抗体FR区可能存在的线性B细胞表位与构象型B细胞表位，进行表位扫描包括线性表位扫描与构象性表位扫描; 线性表位扫描方法:以每六个多肽段为一组探针进行，在多重序列比对中每次向前位移I个氨基酸，逐位进行扫描，如果一段表位肽没有在任何人的抗体序列中有重复，也不能用NCBI_Blast工具在Genbank找到人抗体相同的多肽序列，则此多肽定义为可能的线性表位； 构象型表位扫描方法:将所有的突变点在空间距离上进行分析(用先前构建的Fab模型)，最小以两个突变点为单位，凡是在空间距离小于3埃的，且该单位没有在任何人的下载的人抗体相应序列中出现的，则定义为一个构象型表位。4.虚拟突变与分子动力学模拟，包括以下步骤: 采用虚拟突变结合分子动力学模拟来定位影响抗体CDR区构象的关键氨基酸，将表位扫描后确定的人源化氨基酸突变利用分子建模软件分别构建单个点突变的模型与多个点组合突变的模型，突变体经过能量最小化及简短的体系平衡模拟后，在310K与一个大气压的等温等压(NPT)系综和周期性边界条件下进行IOns显性溶剂水的分子动力学模拟，并从平衡的动力学轨迹中提取稳定的平均构象；突变体分子动力学模拟后再与亲本抗体或嵌合抗体的CDR区进行构象比对，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体人源化改造方法，其特征在于，其包括以下步骤：1）抗体基因序列分析，包括以下步骤：1.1）抗体基因克隆：将动物源的分泌特异性抗体杂交瘤细胞提取总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；根据不同动物源不同抗体亚型可变区设计特异性引物，以cDNA为模板，进行抗体Fab基因PCR扩增，纯化后的PCR产物与克隆载体相连接，连接产物转化感受态细菌，在过夜生长的平板上轻链重链各挑取白色单菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆进行序列测定；1.2）抗体序列分析：将测定的Fab抗体基因的可变区序列VL与VH利用IMGT/V?Quest在线服务器分析抗体亚型，并翻译成氨基酸序列，然后综合Kabat、Chothia及IMGT三种抗体CDRs区的Numbering方案，以最大程度地保持CDRs区氨基酸为原则，确定抗体轻链与重链的六个CDRs区序列；2）抗体Fab的同源建模与优化，包括以下步骤：2.1）抗体Fab初始结构建模：利用同源建模技术来构建动物源亲本抗体Fab及其嵌合人源化抗体Fab的空间结构，同源建模的过程包括模板搜索、初始结构建模、Loop区的构象搜索及初始模型的优化；嵌合抗体模型的构建：利用分子建模工具将动物源抗体可变区与人IgG1抗体的恒定区进行连接构建嵌合抗体的分子模型；2.2）抗体Fab的结构优化：对于亲本抗体Fab与嵌合抗体Fab初始模型采用显性溶剂水环境下的能量最小化与10ns的分子动力学平衡模拟来进行全面的优化，从平衡的动力学轨迹中提取稳定的平均构象；????3）表位扫描确定人源化突变位点，包括以下步骤：3.1）人同源序列的搜索：将抗体可变区VL及VH的氨基酸序列作为探针分别利用NCBI_Balstp工具在Genbank上进行序列搜索与VL及VH相似性最高的所有抗体序列，排除所有的非人源和人源化的同源序列并手动去除不完整或者有错误的序列，下载与VL及VH同源性最高的前50条人源抗体完整序列，作为CDR移植的参考模板，将抗体可变区VL与VH的氨基酸序列分别与下载的人同源序列采用动态规划算法进行多重序列比对；3.2）表位扫描：是为了排除来自多个模板比对后进行人源化替换，导致人源化后的抗体FR区可能存在的线性B细胞表位与构象型B细胞表位，进行表位扫描包括线性表位扫描与构象性表位扫描。...

【技术特征摘要】
1.一种抗体人源化改造方法，其特征在于，其包括以下步骤: 1)抗体基因序列分析，包括以下步骤: 1.0抗体基因克隆:将动物源的分泌特异性抗体杂交瘤细胞提取总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；根据不同动物源不同抗体亚型可变区设计特异性引物，以cDNA为模板，进行抗体Fab基因PCR扩增，纯化后的PCR产物与克隆载体相连接，连接产物转化感受态细菌，在过夜生长的平板上轻链重链各挑取白色单菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆进行序列测定； 1.2)抗体序列分析:将测定的Fab抗体基因的可变区序列VL与VH利用MGT/V-Quest在线服务器分析抗体亚型，并翻译成氨基酸序列，然后综合Kabat、Chothia及MGT三种抗体⑶Rs区的Numbering方案，以最大程度地保持⑶Rs区氨基酸为原则，确定抗体轻链与重链的六个CDRs区序列； 2)抗体Fab的同源建模与优化，包括以下步骤: 2.1)抗体Fab初始结构建模:利用同源建模技术来构建动物源亲本抗体Fab及其嵌合人源化抗体Fab的空间结构，同源建模的过程包括模板搜索、初始结构建模、Loop区的构象搜索及初始模型的优化；嵌合抗体模型的构建:利用分子建模工具将动物源抗体可变区与人IgGl抗体的恒定区进行连接构建嵌合抗体的分子模型； 2.2)抗体Fab的结构优化:对于亲本抗体Fab与嵌合抗体Fab初始模型采用显性溶剂水环境下的能量最小化与IOns的分子动力学平衡模拟来进行全面的优化，从平衡的动力学轨迹中提取稳定的平均构象； 3)表位扫描确定人源化突变位点，包括以下步骤: 3.1)人同源序列的搜索:将抗体可变区VL及VH的氨基酸序列作为探针分别利用NCBI_Balstp工具在Genbank上进行序列搜索与VL及VH相似性最高的所有抗体序列，排除所有的非人源和人源化的同源序列并手动去除不完整或者有错误的序列，下载与VL及VH同源性最高的前50条人源抗体完整序列，作为CDR移植的参考模板，将抗体可变区VL与VH的氨基酸序列分别与下载的人同源序列采用动态规划算法进行多重序列比对； 3.2)表位扫描:是为了排除来自多个模板比对后进行人源化替换，导致人源化后的抗体FR区可能存在的线性B细胞表位与构象型B细胞表位，进行表位扫描包括线性表位扫描与构象性表位扫描。2.线性表位扫描方法包括:在多重序列比对中，以每六个多肽段为一组探针进行，在多重序列比对中每次向前位移I个氨基酸，逐位进行扫描，如果一段表位肽没有在任何人的抗体序列中有重复，也不能用NCBI_Blast工具在Genbank找到人抗体相同的多肽序列，则此多肽定义为可能的线性表位。3.构象型表位扫描方法包括:将所有的突变点在空间距离上进行分析，用来自于结构预测或实验测定的Fab结构，最小以两个突变点为单位，凡是在空间距离小于3埃的，且该单位没有在任何人的下载的人抗体相应序列中出现的，则定义为一个构象型表位； 4)虚拟突变与分子动力学模拟，包括以下步骤: 采用虚拟突变结合分子动力学模拟来定位影响抗体CDR区构象的关键氨基酸，将表位扫描后确...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓辉，张顶，何有文，
申请(专利权)人：广州泰诺迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：