一种单环刺螠血红蛋白及其分离纯化和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种单环刺螠血红蛋白及其分离纯化和应用，所述蛋白系源自单环刺螠腔液，核苷酸和氨基酸序列分析表明其属于新的蛋白，生物学活性实验结果表明，所述蛋白具有一定的抗菌作用，有望进一步研究开发成为临床有效的抗感染药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及蛋白的分离纯化及其应用。
技术介绍
:海洋是人类有待开发的巨大宝贵药物宝藏。经全球海洋科学家们30多年的潜心研究，海洋生物已在医药材料、药物和工具药等方面呈现出巨大的市场潜力。临床应用的海洋资源产品函盖了抗肿瘤、抗病毒、抗血栓、抗炎、工具药与控剂以及保健品和化妆品等。研究表明，20%左右的海洋生物提取物或化合物，显示了类型各异强度不同的生物活性。临床试验结果表明，海洋资源药物通常展现了生物活性高和可选择性强等特点，开发潜力显而易见。美国、日本等国在海洋资源的利用与海洋药物研发方面领先全球，并已获得一批进入II期临床抗肿瘤的海洋药物。研究发现，大量海洋动物的提取物具有抗病毒功能而不干扰机体正常细胞的代谢，为研 发新的抗病毒药物提供了广阔的空间。第一个抗病毒海洋资源药物々作4(&作1^11081(16)，于1955年被美国FDA批准用于治疗人眼疱疹感染。鉴于海洋药用资源开发的诱人前景，人们越来越重视把寻找高效、特异、安全的生物活性药物的目光投向浩瀚的海洋。单环刺婦(Urechis unicinctus)俗名“海肠子”,体呈长圆筒形,体壁较厚,体表光滑，颗粒极细微，吻短，略呈圆锥形，与身体无明显的分界，腹面有纤毛沟，口位于其底部。在口的后方，身体腹面有I对刚毛。身体后端纯圆，肛门位于末端中央，周围有I圈后刚毛，约10 13个。身体柔软，生活时灰白色，酒精浸泡后为淡红色或红褐色。体长不等，一般长160 200mm，粗18 25mm。栖息于泥沙中，作“U”字形管自居，两管口间距离约300mm。单环刺縊是无管縊目，在我国沿海分布的唯一种类。单环刺縊在种属上介于软体动物和环节动物之间，广泛分布于福建、浙江、大连、烟台等地；一年四季皆可采获，资源十分丰富。在闽台，烟台等地成为一道享誉内外的名菜。然而，沿海居民在加工制作单环刺縊海鲜时，通常错误地认为，单环刺縊(海肠子体腔液不具任何利用价值，而被当成海鲜加工污水排放，不仅浪费了资源，也污染了人居和近海海域环境。长期以来，中外学者对于单环刺縊的研究，主要集中在单环刺縊水产养殖、单环刺縊在胁迫下的生理变化、营养成分、营养价值及凝集素的情况等。其中主要有从单环刺縊体腔壁中分离提取凝集素药用价值及活性成分的研究。[Li F.L.等 Journal of Ocean University Qingdao, 1994，24:203-210.；YasuhiroOzeki 等 Comp.Biochem.Physiol.1997，118B (I):1-6。]。在动物血液中含量最多的蛋白是血红蛋白，占血液蛋白的60% 70%，而血液中蛋白质的含量高达17% 18%。血红蛋白含有8种必需氨基酸。许多研究证实，血红蛋白生物活性肽在体内还具有一系列重要的生物活性，如阿片样活性、ACE抑制活性、增强血管舒缓激肽活性、刺激细菌生长活性、镇痛活性、抗菌活性及抗氧化活性等。然而，迄今尚未见有研究本专利技术所述单环刺縊血红蛋白及其功能的相关报道
技术实现思路
:本专利技术对海洋生物单环刺婦进行了其血红蛋白(Urechis unicinctushemoglobin, UU-Hb)的分离纯化、基因克隆、序列测定和分析等项研究。本专利技术提供的一种单环刺縊血红蛋白UU-Hb，是源自单环刺縊腔液，其基因序列为423bp(SEQ N0.1)，编码141个氨基酸(SEQ N0.2)，分子量为15019.576Da。所述研究包括:从单环刺縊腔液中分离蛋白；硫酸铵梯度盐析，DEAE阴离子和分子筛层析，通过聚丙烯变性电泳分离蛋白后，转膜到PVDF上，测定N端序列，并设计相应的引物；提取单环刺縊体壁和体腔细胞的总RNA，RT-PCR获得目的基因片段，连接到质粒载体，转化大肠杆菌；并进一步提取质粒，测定序列；以蛋白质N端为5’序列设计引物及以基因终止密码子反向互补序列上游20碱基为3’引物；通过PCR得到目的基因，测序进一步鉴定正确性。具体技术路线如图1所示。研究结果确证:变性SDS-PAGE显示蛋白的纯化过程，质谱测定其分子量为15kD左右。本专利技术成功地测定了其N端序列，并通过cDNA克隆获得了单环刺縊血红蛋白基因的序列。本专利技术首次公开了一种源自单环刺縊体腔液中血红蛋白的基因序列，并克隆获得该基因。本专利技术初步生物活性实验结果表明，所述单环刺縊血红蛋白对金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌活性，为进一步研发成为临床有效的抗菌药物提供了依据。本专利技术还提供了所述血红蛋白的药物组合物，它是以单环刺縊血红蛋白UU-Hb为有效成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。本专利技术还提供了所述组合物在制备抗感染药物中的应用。附图说明:图1 — UU-Hb基因的克隆路线 图2 — SDS PAGE鉴 定UU-Hb硫酸铵梯度层析结果其中:1 — 30-40%硫酸铵饱和度盐析；2 - 40-50%盐析；3 — 50-60%盐析；4 —60-70%饱和度盐析；5 —蛋白分子量marker图3 — UU-Hb阴离子柱层析其中:1、2 —以磷酸盐缓冲液洗脱；3，4，5 —分别以0.1,0.3,0.5%NaCl浓度洗脱；横座标一时间；纵座标一 A280nm图4 一自然PAGE鉴定蛋白阴离子柱层析结果其中:1 —蛋白marker ；2 — DEAE柱层析2号峰收集样品图5 — SDS PAGE鉴定分子筛层析结果其中:1—蛋白 marker (117KD, 90KD, 49KD, 35KD, 26KD, 19KD) ；2 — S-100 层析 2号峰收集样品图6 —质谱测定蛋白的分子量其中:横坐标一分子量(Da);纵坐标一强度(a.u)图7 —转膜后考马斯染色结果Uu-Hb 转印8 — UU-Hb cDNA 电泳鉴其中:1— DNA maker ；2 — cDNA 第一条链图9 — UU-HbPCR 产物鉴定其中:1— DNA maker ;2，3 —分别为 cDNA PCR 产物 I 和 具体实施方式:《实施例1》UU-Hb样品制备1、UU-Hb的分离和浓缩方法:取50ml单环刺婦体腔液,在12000rpm下离心IOmin,取上清。在上清中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度的30%，40C，放置12h，4°C，IOOOOrpm离心15min，收集沉淀。上清液再进行硫酸铵梯度盐析以硫酸铵终饱和度达到40%、50%、60%、70%，重复上面离心，并收集沉淀，以纯净水溶解沉淀并放在分子量为IOkDa的透析袋中，以纯净水为透析缓冲液透析，直至用1% BaCl2检测没有白色沉淀。分别取透析后的样品SDS-PAGE电泳鉴定。结果:SDS电泳结果见图2。由于血红蛋白在体腔中含量最多，且蛋白表征为红色蛋白，所以可以清楚快速地鉴定。即单环刺縊体血红蛋白含量在硫酸铵30-40%盐析>硫酸铵40-50% >硫酸铵50-60% >硫酸铵60-70%，且血红蛋白纯度关系30-40%盐析>硫酸铵40-50% >硫酸铵50-60% >硫酸铵60-70%。因此本实验得到盐析步骤为30%盐析去沉淀，继续硫酸铵50%离心收集沉淀，透析除盐，冷冻干燥保存，得到Uu-Hb粗品。2、DEAE Sepharose Fast Flow 层析方法:以D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单环刺螠血红蛋白UU?Hb，其特征是，所述蛋白源自单环刺螠腔液，其基因序列为423bp（SEQ?No.1），编码141个氨基酸（SEQ?No.2），分子量为15019.576Da。

【技术特征摘要】
1.一种单环刺縊血红蛋白UU-Hb，其特征是，所述蛋白源自单环刺縊腔液，其基因序列为 423bp (SEQ N0.1)，编码 141 个氨基酸(SEQ N0.2)，分子量为 15019.576Da。2.制备权利要求1所述血红蛋白UU-Hb的方法，其特征是，所述方法主要包括以下步骤: A)硫酸铵梯度盐析； B)透析除盐冷冻干燥，得到粗品； C)D...

【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，
申请(专利权)人：许瑞安，
类型：发明
国别省市：