甲藻细胞壁蛋白的分离提取方法技术

甲藻细胞壁蛋白的分离提取方法，涉及一种细胞壁蛋白质的提取方法。提供一种在提取过程中不仅能避免胞内蛋白或其它物质的污染，而且能够同时解决壁蛋白的丢失问题，能够快速、高效、完整地得到细胞壁蛋白的甲藻细胞壁蛋白的分离提取方法。用混合化学试剂提取第一部分细胞壁蛋白；用热震方法获得分离得到纯细胞壁；在裂解液中提取第二部分细胞壁蛋白；将第一部分细胞壁蛋白和第二部分细胞壁蛋白相加，得全部细胞壁蛋白。可以使细胞保持相对完整的情况下提取壁蛋白，没有胞内蛋白污染，也几乎没有丢失蛋白；时间短，从开始提取至得到全部壁蛋白只需２ｈ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞壁蛋白质的提取方法，尤其是涉及一种甲藻细胞壁蛋白的分离提取 方法。
技术介绍
提取植物细胞壁较为流行的方法是化学试剂顺序提取法，依次用氯化钙，环已烷二胺四 醋酸，二硫苏糖醇，氯化钠(或氯化锂)，硼酸盐提取细胞壁蛋白，每步提取时间是30min， 其缺点是总时间较长，细胞容易在提取过程中破裂，所提取的细胞壁蛋白易被胞内蛋白污染 (Duncan Robertson, Geoffrey P. Mitchell, John S. Gilroy,Differential Extraction and Protein Sequencing Reveals Major Differences in Patterns of Primary Cell Wall Proteins from Plants, /ow77fl/o/Wo/ogz'cfl/c/ e/m'幼y， 1997.272 (25) ，15841-15848);另外，移除胞内物质后再提取 细胞壁蛋白的方法又容易丢失很多壁蛋白。 一般方法不能防止提取过程中的杂蛋白污染和壁 蛋白丢失的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有的植物细胞壁提取方法中细胞壁蛋白既容易被非壁蛋白污 染，又容易丢失壁蛋白的不足，提供一种在提取过程中不仅能避免胞内蛋白或其它物质的污 染，而且能够同时解决壁蛋白的丢失问题，能够快速、高效、完整地得到细胞壁蛋白的甲藻 细胞壁蛋白的分离提取方法。本专利技术包括以下步骤1) 用混合化学试剂提取第一部分细胞壁蛋白；2) 用热震方法获得分离得到纯细胞壁；3) 在裂解液中提取第二部分细胞壁蛋白；4) 将第一部分细胞壁蛋白和第二部分细胞壁蛋白相加，得全部细胞壁蛋白。 所述混合化学试剂的组成及其按摩尔比的含量最好为0.2 M氯化钙，50 mM环己烷二胺四乙酸溶于50 mM乙酸钠(pH 6.5)， 2 mM二硫苏糖醇，1 M氯化钠，0.2 M硼酸钠(pH 7.5)。所述热震方法最好是首先在4'C孵浴，然后在室温静置，使细胞壁与细胞质分离。 所述裂解液的成分最好包括7M尿素，2M硫脲，2%w/vCHAPS， 2% v/v Triton-XlOO，1% w/v 二硫苏糖醇，2%两性电解质。本专利技术利用针对细胞壁蛋白提取的混合化学试剂一次性提取甲藻细胞的部分细胞壁蛋白 (第一部分蛋白)，氯化钙用于提取细胞壁蛋白，环己烷二胺四乙酸能提取胶质结合蛋白，二 硫苏糖醇可以还原蛋白之间的相互作用，氯化钠提取离子结合蛋白，硼酸盐打破了糖蛋白侧链和多糖在细胞壁中引起的相互作用。此步提取的细胞壁蛋白易溶于水，且与细胞壁结合疏 松，提取时间短，防止了细胞长时间在化学试剂中造成破裂之后的污染。再用热震方法将细 胞壁与细胞质体分离开来，并通过低速离心使细胞壁与细胞质在离心管中分为上下两层，大 量收集细胞壁后，再用蛋白质强提取剂提取细胞壁难溶蛋白(第二部分蛋白)。最后将第一、 第二部分混合成为全部的细胞壁蛋白，再利用蛋白质组学技术和生物质谱技术鉴定分析。本专利技术的有益效果是，可以使细胞保持相对完整的情况下提取壁蛋白，没有胞内蛋白污 染，也几乎没有丢失蛋白；时间短，从开始提取至得到全部壁蛋白只需2h。 附图说明图l是细胞壁与细胞质在离心管中的示意图。由图l可以看出，细胞壁与细胞质在离心管 中分为上下两层，上层为细胞壁。图2是在离心管中大量收集的链状亚历山大藻细胞壁。图3是亚历山大藻细胞壁SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。在图3中，横坐标为/P,纵坐 标为Kda,横向箭头为/￡凡纵向箭头为SDS-PAGE;图中标注的是质谱鉴定过的蛋白点。 具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术方法作进一步说明。混合试剂成分包括0.2M氯化钙，50mM环己烷二胺四乙酸溶于50mM乙酸钠(pH 6.5), 2mM二硫苏糖醇，lM氯化钠，0,2M硼酸钠(pH7.5);裂解液成分包括7M尿素，2M硫脲， 2%w/vCHAPS， 2%v/vTriton-X100， 1。/。w/v二硫苏糖醇，2%两性电解质。收集2X 107亚历山大藻到15ml离心管中，加入5ml混合提取化学试剂，在fC提取60min， 每10min震荡一次，使管中的藻细胞混合均匀，4'C， 5000Xg离心收集上清(上清l);沉淀 中再加入少量海水，再于4。C孵育30min，在室温下静置10min，之后室温下5000Xg离心， 离心管中细胞壁与细胞质分为上下两层，白色上层是细胞壁，下层是细胞质(参见图l和2)， 将上层细胞壁转移至另一个离心管中，加入强裂解液，超声破碎细胞壁5min，室温18， 000 Xg离心，收集上清(上清2);上清1与上清2混合得全部细胞壁蛋白，加入20%TCA-Acetone 于-2(TC沉淀不少于45min， 20， OOOXg离心，弃上清，用100%丙酮清洗两次，将沉淀溶于 溶涨液，用双向凝胶电泳显示细胞壁蛋白(见图3)，并对蛋白做生物质谱鉴定。权利要求1. ，其特征在于包括以下步骤1)用混合化学试剂提取第一部分细胞壁蛋白；2)用热震方法获得分离得到纯细胞壁；3)在裂解液中提取第二部分细胞壁蛋白；4)将第一部分细胞壁蛋白和第二部分细胞壁蛋白相加，得全部细胞壁蛋白。2. 如权利要求l所述的，其特征在于所述混合化学试剂 的组成及其按摩尔比的含量为0.2M氯化钙，50mM环己烷二胺四乙酸溶于50 mM乙酸钠， 2mM二硫苏糖醇，1M氯化钠，0.2M硼酸钠。3. 如权利要求l所述的，其特征在于所述热震方法是首 先在4i:孵浴，然后在室温静置，使细胞壁与细胞质分离。4. 如权利要求l所述的，其特征在于所述裂解液的成分 包括7M尿素，2M硫脲，2%w/vCHAPS， 2% v/v Triton-XlOO， 1。/。w/v二硫苏糖醇，2%两 性电解质。全文摘要，涉及一种细胞壁蛋白质的提取方法。提供一种在提取过程中不仅能避免胞内蛋白或其它物质的污染，而且能够同时解决壁蛋白的丢失问题，能够快速、高效、完整地得到细胞壁蛋白的。用混合化学试剂提取第一部分细胞壁蛋白；用热震方法获得分离得到纯细胞壁；在裂解液中提取第二部分细胞壁蛋白；将第一部分细胞壁蛋白和第二部分细胞壁蛋白相加，得全部细胞壁蛋白。可以使细胞保持相对完整的情况下提取壁蛋白，没有胞内蛋白污染，也几乎没有丢失蛋白；时间短，从开始提取至得到全部壁蛋白只需2h。文档编号C07K14/405GK101503465SQ200910111198公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月10日 优先权日2009年3月10日专利技术者成 李, 洪华生, 王大志, 荔 陈 申请人:厦门大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
甲藻细胞壁蛋白的分离提取方法，其特征在于包括以下步骤：　１）用混合化学试剂提取第一部分细胞壁蛋白；　２）用热震方法获得分离得到纯细胞壁；　３）在裂解液中提取第二部分细胞壁蛋白；　４）将第一部分细胞壁蛋白和第二部分细胞 壁蛋白相加，得全部细胞壁蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王大志，李成，陈荔，洪华生，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]