一种分离液泡和观察液泡膜上蛋白分布和运动的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离液泡和观察液泡膜上蛋白分布和运动的方法。该方法依次包括如下步骤：(1)取植物组织，用酶解液进行处理，获得原生质体；(2)裂解所述原生质体，获得液泡；(3)多聚甲醛载玻片固定液泡；(4)全内光反射显微镜观察液泡膜上蛋白分布和运动。实验证明，采用本发明专利技术所提供的方法分离的液泡是具有生理活性的液泡，其液泡膜上蛋白质也是具有生理活性的，且可利用全内反射荧光显微镜观察液泡膜上蛋白的运动和分布。本发明专利技术将以TIRFM显微镜为基础的单分子技术的观测范围从细胞外膜扩展到胞内细胞器膜，所提供的方法在液泡的分离及观察中具有重要的应用价值，为深入研究植物的细胞器奠定了技术基础。

Method for separating vacuole and observing protein distribution and movement on tonoplast membrane

The invention discloses a method for separating vacuoles and observing the distribution and movement of proteins on the tonoplast membrane. The method comprises the following steps: (1) the plant tissue treated with enzyme solution, obtain protoplast; (2) cracking the protoplast, obtain the vacuole; (3) paraformaldehyde fixed slides vacuole; (4) total internal reflection microscopy to observe light vacuolar membrane protein distribution and exercise. The experiment proved that the separation method provided by the invention of the vacuole is physiologically active vacuoles, its vacuole membrane protein also has physiological activity, and can use the total internal reflection fluorescence microscope to observe the movement and distribution of the vacuolar membrane protein. In the invention, the single molecule technology by TIRFM microscope based observation range from the cell membrane extended to intracellular organelle membrane, the method has important application value in the separation and observation of vacuoles, laid the foundation for further study of plant cells.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种分离液泡和观察液泡膜上蛋白分布和运动的方法。
技术介绍
以往的科学研究只是在大量分子的综合平均效应上进行科学探索，而单分子技术打破这一群体平均化的限制，逐一地对单个分子进行追踪。利用单分子技术，人们可以实时地监测并分析分子间相互作用的过程、构象变化以及生化反应的动力学参数。单分子技术的运用在生物学、化学、医学以及纳米材料等科学领域都具有重要意义，提供了一种全新的手段以助于研究一些亟待解决的前沿问题。细胞内很多至关重要的生命活动过程都是在细胞膜表面完成的，例如信号转导、蛋白质转运等。在生物学研究中，单分子显微成像技术显得尤其重要。全内反射荧光技术是当今最灵敏的单分子显微成像和检测方法之一，可以仅激发深度在100nm～300nm薄层范围内的荧光基团，探测单个荧光分子而不受其它层面的荧光信号的干扰，与其它光学切片成像技术相比其在Z轴上的分辨率独具优势。基于这个想法，科学家们专利技术了基于全内反射的荧光显微镜—全内反射荧光显微镜(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM)。已有的研究报道，可利用TIRFM观察植物细胞膜上蛋白质的运动，但尚未将该技术扩展到观察植物细胞器膜上蛋白质的运动，原因在于观察植物细胞器存在提取困难、固定困难等种种问题。液泡是植物细胞所特有的细胞器，体积约占成熟植物细胞的90％，并具有单层液泡膜将其与细胞质分开。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何分离液泡和观察液泡。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种观察植物液泡的方法。本专利技术提供的观察植物液泡的方法，包括如下步骤：取植物组织，分离获得液泡，然后将所述液泡置于经多聚赖氨酸处理的装置上进行观察。上述观察植物液泡的方法中，所述观察采用TIRFM显微镜进行。上述观察植物液泡的方法中，所述“多聚赖氨酸处理”可为将所述装置置于浓度为0.01mg/mL以上的多聚赖氨酸水溶液中浸泡15min以上。上述观察植物液泡的方法中，所述“多聚赖氨酸处理”具体可为将所述装置置于浓度为0.01mg/mL的多聚赖氨酸水溶液中浸泡15min。所述装置可为载玻片。上述观察植物液泡的方法中，所述“多聚赖氨酸处理”在置于所述多聚赖氨酸水溶液中浸泡之前，还可依次经过如下处理：酸液浸4h、水(如自来水)中浸泡2h和去离子水润洗。所述酸液可由浓HCl和70％(体积百分比)乙醇水溶液按照体积比1：100混合而成。所述去离子水润洗次数为2次，每次润洗10-15s。上述观察植物液泡的方法中，所述“分离获得液泡”的方法，依次可包括如下步骤：(1)取植物组织，用酶解液进行处理，获得原生质体；所述酶解液中可含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纤维素酶、10-100U/mL离析酶、8-12mM CaCl2、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巯基乙醇；(2)裂解所述原生质体，获得液泡。所述步骤(1)中，所述酶解液和所述植物组织的配比可为10-15mL：1g。所述步骤(1)中，所述酶解液和所述植物组织的配比具体可为10mL：1g。所述酶解液具体可为含有0.4M甘露醇、20mM MES、10mM KCl、15U/mL纤维素酶、50U/mL离析酶、10mM CaCl2、0.001g/mLBSA和0.7μL/mLβ-巯基乙醇的水溶液，pH值为5.7-5.9。所述步骤(1)中，所述植物组织可为z1)或z2)或z3)或z4)或z5)：z1)植物的叶片；z2)拟南芥的叶片；z3)拟南芥的莲座片；z4)表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥的叶片；z5)表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥的莲座片。所述步骤(1)中还可包括如下步骤：进行所述处理前，对所述植物组织进行表面消毒。所述表面消毒的具体方法可为：用70-75％乙醇水溶液冲洗所述植物组织2-3次，每次冲洗10-15s。所述步骤(1)中，所述处理的参数可为a1)或a2)：a1)避光、25-29℃、3-4h；a2)避光、25-29℃振荡3-4h。所述a2)中，所述振荡的参数可为摇速40-70rpm(如40rpm、50rpm、60rpm或70rpm)，旋转半径可为40-60mm(如40mm、50mm或60mm)。所述步骤(1)中，所述处理的参数具体可为27℃振荡4h，振荡的参数具体可为摇速70rpm，旋转半径50mm。所述步骤(1)中还可包括如下步骤a：完成所述处理后，收集原生质体。所述步骤a中，所述收集原生质体的方法可为：过滤，收集滤液，然后将所述滤液进行离心并收集沉淀甲，所述沉淀甲中含有原生质体。所述步骤a中，收集原生质体的方法中的离心可为4-6℃离心15-20min，离心参数可为60-100g、brake1-4。所述步骤a中，收集原生质体的方法中的离心具体可为4℃离心20min，离心参数具体可为80g、brake1。所述过滤可使用筛子(如目数为150孔)、尼龙网或医用纱布进行。所述过滤具体可使用孔径为100μm的尼龙网进行。所述步骤(1)中还可包括如下步骤b：完成步骤a后，取沉淀甲，使用洗涤液洗涤，然后离心并收集沉淀乙，所述沉淀乙中含有原生质体；所述洗涤液中含有0.3-0.5M甘露醇和15-25mM MES。所述洗涤液具体可为含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。所述步骤b中，洗涤的方法中的离心可为4-6℃离心15-20min，离心参数可为60-100g、brake1-4。所述步骤b中，洗涤的方法中的离心具体可为4℃离心20min，离心参数具体可为80g、brake1。所述步骤(2)中还可包括如下步骤c：完成所述裂解后，离心并收集上清液，所述上清液中含有液泡。所述步骤c中，裂解后的离心可为4-6℃离心1-10min，离心参数可为60-150g、brake1－4。所述步骤c中，裂解后的离心具体可为4℃离心5min，离心参数具体可为100g、brake1。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种从植物组织中分离液泡的方法。本专利技术所提供的从植物组织中分离液泡的方法，依次可包括如下步骤：(A)取植物组织，用酶解液进行处理，获得原生质体；所述酶解液中可含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纤维素酶、10-100U/mL离析酶、8-12mM CaCl2、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巯基乙醇；(B)裂解所述原生质体，获得液泡。所述步骤(A)中，所述酶解液和所述植物组织的配比可为10-15mL：1g。所述步骤(A)中，所述酶解液和所述植物组织的配比具体可为10mL：1g。所述酶解液具体可为含有0.4M甘露醇、20mM MES、10mM KCl、15U/mL纤维素酶、50U/mL离析酶、10mM CaCl2、0.001g/mLBSA和0.7μL/mLβ-巯基乙醇的水溶液，pH值为5.7-5.9。所述步骤(A)中，所述植物组织可为z1)或z2)或z3)或z4)或z5)：z1)植物的叶片；z2)拟南芥的叶片；z3)拟南芥的莲座片；z4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种观察植物液泡的方法，包括如下步骤：取植物组织，分离获得液泡，然后将所述液泡置于经多聚赖氨酸处理的装置上进行观察。

【技术特征摘要】
1.一种观察植物液泡的方法，包括如下步骤：取植物组织，分离获得液泡，然后将所述液泡置于经多聚赖氨酸处理的装置上进行观察。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“分离获得液泡”的方法，依次包括如下步骤：(1)取植物组织，用酶解液进行处理，获得原生质体；所述酶解液中含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纤维素酶、10-100U/mL离析酶、8-12mMCaCl2、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巯基乙醇；(2)裂解所述原生质体，获得液泡。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述处理的参数为a1)或a2)：a1)避光、25-29℃、3-4h；a2)避光、25-29℃振荡3-4h。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中还包括如下步骤a：完成所述处理后，收集原生质体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述收集原生质体的方法为：过滤，收集滤液，然后将所述滤液进行离心并收集沉淀甲；所述沉淀甲中含有原生质体。6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中还包括如下步骤b：完成步骤a后，取沉淀甲，使用洗涤液洗涤，然后离心并收集沉淀乙；所述沉淀乙中含有原生质体；所述洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，吴鸿洋，吕雪芹，李晓娟，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11