本发明专利技术涉及一种重组质粒DNA疫苗，本发明专利技术重组质粒DNA疫苗同时携带乙肝表面抗原蛋白编码基因和乙肝核心抗原蛋白编码基因，在所构建的重组质粒DNA疫苗上包括两个目的蛋白表达盒，其中一个为优化的目的蛋白表达盒，两个基因之间彼此通过一个目的蛋白表达盒隔开，本发明专利技术还涉及一种双质粒DNA疫苗，该双质粒DNA疫苗包括本发明专利技术所述重组质粒DNA疫苗和重组白介素12佐剂质粒。本发明专利技术构建的重组质粒DNA疫苗和及其组合物可用于制备具有预防和治疗乙型肝炎的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种治疗乙肝疾病的重组质粒DNA疫苗及其组合物，属于生物医学领域。
技术介绍
乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后机体缺乏持久的特异性细胞免疫及体液免疫。HBV外壳蛋白是有大蛋白LS (S1S2S抗原，由前S1-前S2-S基因编码)、中蛋白MS(S2S抗原，由前S2-S基因编码)、小蛋白S (S抗原，由S基因编码)三种分子构成，其中，前S2抗原分子量小，抗原性强，涉及乙肝病毒对宿主细胞的吸附，因而含前S2抗原的疫苗对于接种者的保护作用应更为有效。HBcAg是由乙型肝炎病毒基因C区基因编码，从第2个ATG起始翻译，含183-185个氨基酸多肽，分子量约为21KD，其C端富含精氨酸和多种蛋白酶作用位点，有结合RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗粒密切相关。HBcAg颗粒由多个核心蛋白亚基构成，呈正二十面体对称的颗粒样结构，单个核心蛋白亚基(包括183-185个氨基酸多肽链)先形成同型二聚体(Homodimer), 二聚体再进一步聚集而形成HBcAg颗粒。重组质粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组质粒直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。与传统的疫苗相比，重组质粒DNA疫苗不仅能有效诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，可兼做预防和治疗性疫苗，DNA质粒疫苗已经在许多疾病的治疗和预防方面显示出广泛的应用前景。Mancini (Manc ini M, HadchoueI M, Davis HL, et al.DNA-mediatedimmunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigenchronic carrier state.Pro Natl Acad Sci USA.1996,93:12496-12501)等应用编码preS2/SHBV包膜蛋白的重组质粒免疫HBV转基因小鼠，经过一次肌肉注射就能清除转基因小鼠循环中的HBsAg，并且能够长期抑制肝细胞中的病毒复制，证实了 DNA疫苗在治疗慢性乙肝携带者的潜在优势。Mancin1-Bourgine M等(Mancin1-BourgineM,Fontaine H, Scott-Algara D, et al.1nduction or expansion of T—cell responseseby a hepatitis B DanA vaccine administered to chronic HBV carriers.Hepatology.2004, 40:874-882)应用编码preS2/S HBV包膜蛋白的重组质粒免疫10例慢性乙肝携带者，这10例携带者未接受过任何的抗病毒治疗。结果发现，疫苗能够很好地耐受，有2例携带者的PBMC发生抗原特异性的T淋巴细胞增殖反应，并且HBV特异性分泌IFN- Y的T细胞数目在免疫后有较大幅度的提高，有5例携带者的血清HBV DNA水平下降，但是这种下降仅仅是暂时性的。此次研究也证实了 HBV DNA疫苗的安全性以及能够在部分慢性乙肝携带者体内诱导出特异的T细胞免疫应答。HBcAg作为优势抗原,在乙肝疫苗的研究中也得到了广泛应用，Veremeiko TA等(Veremeiko TA, Lebedev LR, Chikaev NA, et al.Humoral immune response of Balb/c mice immunized with chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surfacehepatic B virus protein.Vopr virusol, 2007，52:40-45)把 HBV 外壳蛋白表位插入至IjHBcAg,成功构建了 HBcAg-HBsAg融合蛋白，并以此融合蛋白免疫Balb/cxiaoshi ,产生了高滴度的针对插入表位HBsAg和载体蛋白HBcAg抗体。张炜等(张炜，懂生福，孙淑惠，等.乙肝病毒核心抗原DNA疫苗诱导小鼠抗原特异性CD8+T细胞动态变化和动态分布.中国免疫学杂志.2004, 20 (6): 379-383)研究了重组HBcAg真核表达质粒pHBcl44对C57BL/6小鼠的免疫作用，结果发现，pHBcl44面以后抗原特异性CD8+T细胞逐渐增多，在初次免疫的第14天出现第一个免疫应答高峰，此后抗原特异性CD8+T细胞数量组建下降进入免疫记忆期并在I年内维持在稳定水平。胸腺肽、GSF、IL-2、IL_4、IL-12或IFN- Y等为常作为免疫佐剂或增强剂，其中将胸腺肽、63 、几-2或0^-￥作为佐剂与HBV疫苗联合使用已有研究。IL-12具有多种生物活性，是最强的N K细胞激活因子，可促进CD4+ThO细胞分化为Thl细胞，可协调亚适剂量IL-2诱导LAK(activated killer cells)细胞活性。作为重要的免疫调节分子，IL-12是迄今所知诱导Thl型免疫应答的最主要的细胞因子，原体如细菌、寄生虫、真菌和病毒感染所致疾病及肿瘤的DNA疫苗的研究。中国专利CN1316518A公开了一种重组真核表达质粒pS2S，质粒中含有细胞击落刺激因子，并将重组疫苗质粒与含IL-2和IFN- Y的重做佐剂质粒联合使用，发现发现重组佐剂质粒可以提高重组疫苗质粒的免疫和治疗作用。目前该项目已进入临床研究阶段。将乙肝表面抗原与乙肝核心抗原联合构建重组疫苗质粒时，现阶段通常是利用HBcAg能装配成直径为27nm的颗粒状结构的特点，直接以HBcAg作为表达载体将乙肝病毒表面抗原融合到HBcAg，构建得到融合蛋白疫苗，或者扩增HBV的S和C基因并拼接成SC融合片段，将融合片段插入真核表达载体中构建融合表达HBsAg/HBcAg的重组DNA质粒。但这种方式构建得到的重组DNA质粒，在获得其中一种抗体滴度时，另一种抗原所产生的抗体滴度很弱，下降明显。 虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人满意，但其免疫效果还未达到理想水平，因此如何增强免疫效果已成为DNA疫苗研究的关键，尤其是在如何保证如何使DNA疫苗可同时获得较强的HBsAg和HBcAg的免疫效果方面。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于治疗乙型肝炎的经优化的重组质粒DNA疫苗，所述的重组质粒DNA疫苗同时携带乙肝表面抗原蛋白编码基因和乙肝核心抗原蛋白编码基因。本专利技术中，所述的重组质粒DNA疫苗中的乙肝表面抗原蛋白编码基因和乙肝核心抗原蛋白编码基因不是通过直接连接而形成融合蛋白编码基因的形式，而是通过优化质粒，在重组质粒上设计两个目的蛋白表达盒，两编码基因彼此隔开。本专利技术中，HBV便面抗原蛋白编码基因可以是S1S2S蛋白编码基因、S2S蛋白白编码基因或S蛋白编码基因，优选乙肝病毒包膜中蛋白S2S蛋白编码基因就，所述的乙肝核心抗原蛋白编码基因为编码乙肝病毒核心Core蛋白的编码基因。本专利技术中，所述的乙肝病毒S2S蛋白编码基因，其核苷酸序列与Seq ID N0.5具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选为至少90%本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组白介素12佐剂质粒，其特征是所述重组白介素12佐剂质粒包含白介素12P35亚基编码基因、白介素12P40亚基编码基因以及两个目的蛋白表达盒，两个目的蛋白表达盒将P35亚基编码基因及P40亚基编码基因彼此分隔开。
【技术特征摘要】
1.重组白介素12佐剂质粒，其特征是所述重组白介素12佐剂质粒包含白介素12P35亚基编码基因、白介素12P40亚基编码基因以及两个目的蛋白表达盒，两个目的蛋白表达盒将P35亚基编码基因及P40亚基编码基因彼此分隔开。2.根据权利要求1所述的重组白介素12佐剂质粒，其特征在于所述重组佐剂质粒还包括大肠杆菌复制起始点ColEl、卡那抗性基因序列Kan;所述两个目的蛋白表达盒中，处于上游位置的表达盒为优化目的蛋白表达盒，其包括来源于SV40的增强子元件Enhancer、免疫调节序列CpG。3.根据权利要求1所述的重组白介素12佐剂质粒，其特征在于所述重组白介素12佐剂质粒为重组人白介素12佐剂质粒(phIL12)或重组鼠白介素12佐剂质粒(pmhIL12)。4.根据权利要求3所述的重组白介素12佐剂质粒，所述phIL12的核苷酸序列如SeqID N0.3所示，其包含hP35亚基编码基因和hP40亚基编码基因，所述hP35亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID N0.9所示，所述hP40亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID N0.10所示。5.根据权利要求3所述的重组白介素12佐剂质粒，所述pmIL12的核苷酸序列如SeqID N0.4所示，其包含mP35亚基编码基因和mP40亚基编码基因，所述mP35亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID N0.7所示,所述mP40亚基编码基因核苷酸序列如Seq ID N0.8所示。6.构建权利要求4所述的重组人白介素12佐剂质粒phIL12的方法，其特征在于包括如下步骤: 将合成基因hP35通过HindIII+Xbal双酶切与HindIII+Xbal双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.l_hP35，其中合成基因hP35的核苷酸序列如Seq IDN0.9所示； 通过Bglll+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.l_hP35中切出hP35基因表达盒，克隆入Bglll+EcoRV 双酶切的 质粒 pRec2.0_PreS2S 中，获得重组质粒 pRec2.0_PreS2S_hP35 ； 将合成基因hP40通过HindIII+Xbal双酶切与HindIII+Xbal双酶切的载体pcDNA3.1进行连接，构建获得重组质粒pcDNA3.l_hP40，其中合成基因hP40的核苷酸序列如Seq IDN...
【专利技术属性】
技术研发人员：李鼎峰，刘勇，周德胜，张春丽，
申请(专利权)人：北京凯因科技股份有限公司，北京凯因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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