高产酸性纤维素酶和淀粉酶的酵母菌制造技术

本发明专利技术涉及微生物领域，具体地涉及高产酸性纤维素酶和淀粉酶的酵母菌株，其保藏编号为CGMCC?No.5987。本发明专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有对嗜酸环境微生物分离，提供一种产酸性酶的菌株。本发明专利技术的菌株经鉴定为红冬孢酵母菌，生长最适pH为3.0，其产酶在pH3.0～5.0都有较高的酶活性；可使其在需求酸性环境的工业生产上应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物领域，具体地涉及高产酸性纤维素酶和淀粉酶的酵母菌。
技术介绍
嗜酸菌是一类极其重要的极端微生物，主要分布在酸性矿山废水、土壤和温泉中。其中，酸性矿山废水PH值通常在3以下，并含有高浓度的重金属阳离子和硫酸根阴离子。嗜酸菌分泌的胞外酶往往是相应的嗜酸酶。由于其嗜酸特性，大量酸性酶被广泛应用在酸性环境的工业中。例如，生淀粉降解的嗜酸淀粉酶、作为饲料添加剂的嗜酸木聚糖酶、嗜酸甘露聚糖酶以及嗜酸纤维素酶。在植物细胞壁中，纤维素是自然界中最丰富的可再生的生物质资源，约占地球上每年光合作用产生的生物质的一半。但是由于其结构复杂，单一酶很难有效降解，而且转化效率低。在饲料行业，由于动物胃肠道处于酸性pH下，需要添加大量的微生物来源的酸性纤维素、半纤维素酶。另外，淀粉深加工是 农业副产品升值的主要途径，淀粉质原料的水解在传统工业上分液化和糖化二个步骤，工序复杂，成本高。而使用酸性淀粉酶与商业化酸性糖化酶一步双酶法处理，能简化制作工艺，提高发酵产物的高效转化和出糖率。减低了工业劳动强度，增加了原料利用率，降低生产成本，提高生产效益。尽管嗜酸菌已被人们作为极端微生物的重要类群，但目前，对嗜酸菌的研究还主要集中在少数细菌和真菌，对酸性酵母菌的研究知之甚少。因此，进一步对嗜酸酵母菌进行更为广泛深入的研究，以真正发挥其科学价值和应用价值。本专利技术从江西铀矿微生物浸铀尾液(pH2. 03. O)这一极端嗜酸环境中分离嗜酸酵母菌，并利用液体发酵的方法分析其产酶情况，结果发现红冬孢酵母菌Rhodosporidium toruloidesstrain RBS-9产丰富的纤维素酶和淀粉酶，其最适PH3. O-4.0，在酸性和中性条件下具有很高的酶活力。为研究嗜酸酵母菌的产酶特性及后期应用提供了良好的科研材料。
技术实现思路
基于目前对嗜酸酵母菌研究不足，本专利技术的目的是从特色的嗜酸环境江西铀矿微生物浸铀尾液中分离产酸性酶的酵母菌株，从而研究嗜酸及产酶机制。本专利技术提供了高产酸性纤维素酶和淀粉酶的菌株，该细菌菌株命名为红冬孢酵母菌(Rhodosporidium SP. ) RBS-9，于2012年4月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是CGMCC No. 5987。根据本专利技术的具体实施方式，从江西铀矿微生物浸铀尾液分离产酸性糖苷水解酶菌株，其分离方法是取样品20mL，加入到80mL富集培养基(pH3. O)中30°C、160rpm振荡培养72h后，分别转接至马铃薯液体培养基以同样的条件培养两代，平行重复3次。取富集培养物在马铃薯固体培养基进行划线稀释，获得单菌落，多次重复划线稀释以获得纯培养，斜面保藏于4°C冰箱。本专利技术的再一目的是提供一种产酸性纤维素酶和淀粉酶的液体发酵方法。因此,本专利技术还提供了上述红冬孢酵母菌(Rhodosporidium SP. ) RBS-9用于发酵制备酸性纤维素酶和淀粉酶的应用。根据本专利技术的具体实施方式，上述酵母菌在PDB液体培养基(pH3. O)培养16h后获得新鲜种子液，再将种子液按照1%的接种量转入产酶培养基中，30°C，160rpm振荡培养72h后，离心取上清液，利用不同酶标准测定方法测定其酶活，并利用不同pH缓冲液测定酶的最适pH。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有对嗜酸环境微生物分离，提供一种产酸性酶的酵母菌株。本专利技术的菌株最适PH为3. 0，最适温度30°C，其产酶在pH3. O 4. O都有较高的酶活性；可使其在需求酸性环境的工业生产上应用。附图说明图1菌株RBS-4所产葡萄糖苷酶的最适pH ；图2菌株RBS-4所产纤维素酶的最适pH ；图3菌株RBS-4所产淀粉酶的最适pH ；红冬孢酵母菌(Rhodosporidium SP.) RBS-9，于2012年4月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是CGMCC No. 5987。 具体实施例方式实施例1菌株分离富集培养基(g/L) (NH4) 2S043. O, KC10. 1，K2HPO4O. 5，MgSO4 · 7Η200· 5，Ca(NO3)2O. 01，FeSO4 · 7Η203· 0，葡萄糖 2，pH 值 2· O 2· 5。分离培养基(g/L) (NH4) 2S042. 0，KC10. 1，MgSO4 · 7Η200· 25，Ca(NO3)2O. 01，葡萄糖1.0，酵母提取物0. 1，pH值2. 5 3. O。马铃薯液体培养基200g马铃薯汁，20g葡萄糖，pH3. O。马铃薯固体培养基200g马铃薯，20g葡萄糖，25g琼脂，pH3. O。取江西铀矿微生物浸铀的尾液10mL，加入到IOOmL富集培养基中30°C、160rpm振荡培养72h后，挑取单菌落分别转接至分离培养基以同样的条件培养两代，平行重复3次。取富集培养物在马铃薯固体培养基进行划线稀释，获得单菌落，再多次重复划线稀释以获得纯培养。利用体视显微镜和相差显微镜观察分离到菌株的菌落形态和菌体形态。RBS-9单菌落分离于马铃薯固体培养基，到3天时观察发现，菌落表面柔软，边缘完整，呈粉红色或红色。边缘光滑，无透明圈。细胞为圆形或椭圆形，出芽生殖，无假菌丝生成。本专利技术的菌株最适PH为3. O,生长温度为30°C。经ITS序列比对发现其属于红冬孢酵母菌 Rhodosporidium toruloides,因此，将菌株 RBS-9 命名为分枝杆菌 Rhodosporidiumtoruloides strain RBS—9。实施例2菌株液体发酵产酶分析纤维素酶类发酵培养基(g/L) (NH4)2S042. 0，K2HPO4L 0，；MgS04 · 7Η200· 5 ;麦麸10g，ρΗ3· O0淀粉酶类发酵培养基(g/L) (NH4)2S042. 0，K2HPO4L 0，；MgS04 · 7H200. 5 ;土豆淀粉10g，ρΗ3· O0DNS法具体方法如下在pH3. 0，50°C条件下，ImL的反应体系包括100 μ L适当的稀释酶液，900 μ L底物(羧甲基纤维素钠或可溶性淀粉)，反应IOminjpA1. 5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却至室温后于540nm测定OD值。I个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出I μ mo I还原糖的酶量。pNPG法底物对硝基苯β -D葡萄糖苷(pNPG)以2mM的浓度250uL溶于pH4. O缓冲液中，加入250uL适当稀释的酶液，在50°C反应IOmin后，加入1. 5mLIMNa2CO3,在405nm下测定OD值。酶活单位定义为在最适温度和条件下，每分钟释放lumol pNP所需要的酶量(U/mL)。用灭过菌的牙签挑取马铃薯固体平板上的单菌落于发酵培养基中，30°C、220r/min、150mL/500mL的条件下振荡培养72h，培养过程中观察菌体生长状况。发酵液在4°C下lOOOOr/min离心20min，上清液即为粗酶液，用于检测β -葡萄糖苷酶、纤维素酶、淀粉酶等3种不同糖苷水解酶的酶活力。经测定，菌株培养72h后本文档来自技高网...

【技术保护点】
高产酸性纤维素酶和淀粉酶的酵母菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC?No.5987。

【技术特征摘要】
1.高产酸性纤维素酶和淀粉酶的酵母菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo. 5987。2.权利要求1所述高产酸性纤维素酶和淀粉酶的酵母菌用于发酵制备酸性纤维素酶和淀粉酶的应用。3.一种产酸性纤维素酶和淀粉酶的液体发酵方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李江，王学刚，吕飞龙，刘亚洁，孙占学，徐玲玲，史维俊，牛建国，石鹏君，姚斌，
申请(专利权)人：东华理工大学，
类型：发明
国别省市：