α‑淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及α‑淀粉酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及α-淀粉酶变体。本专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。【专利说明】α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 序列表的引用本申请含有呈计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。相关技术说明α -淀粉酶(E.C.3.2.1.1)构成催化淀粉、糖原以及相关多糖以及低聚糖的水解的一组酶。α-淀粉酶在商业上用于各种用途，如在淀粉加工(例如，液化)的初始阶段中；在湿磨过程中；以及在从碳水化合物来源产生醇中。它们还用作清洗剂或在洗涤剂基质中的辅助物；在纺织工业中用于淀粉退浆；用于烘焙应用中；用于饮料行业中；用于油田的钻探过程中；在回收过程中例如用于使纸去墨；以及用于动物饲料中。例如用于淀粉液化的一些商业α -淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。已经开发野生型酶的蛋白质工程化变体来克服过程问题。然而，仍然需要具有改进特性的新颖α -淀粉酶，如在低pH、低钙以及高温下的较高稳定性。这类酶将允许淀粉液化过程在降低的PH下进行，这对于化学品节省具有积极影响。`本专利技术的目标是提供在低pH`下和/或在高温下，尤其在低钙浓度下具有增加稳定性的新颖α-淀粉酶变体。
技术实现思路
本专利技术人已经发现包括与在对应于SEQ ID Ν0:1的位置15、48、49、50、107、116、133、138、156、176、181、187、188、190、197、201、205、209、213、239、241、255、264、299、360、375、416、437、474以及475的一个或多个位置处的取代组合的在对应于位置185的位置处用脯氨酸进行的取代的α -淀粉酶变体在低PH下和/或在高温下，尤其在低钙浓度下具有增加的稳定性。因此，本专利技术涉及包括在对应于SEQ ID NO:1的位置185的位置处用脯氨酸进行的取代并且进一步包括在对应于SEQ ID NO:1的位置15、48、49、50、107、116、133、138、156、176、181、187、188、190、197、201、205、209、213、239、241、255、264、299、360、375、416、437、474以及475的一个或多个位置处的取代的α-淀粉酶变体，其中该变体与以下具有至少60% 并且小于 100% 的序列一致性:(i)SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14中的任何一个的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 2的氨基酸I 至 483、SEQ ID NO:3 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO:4 的氨基酸 I 至 482、SEQ ID NO:5 的氨基酸I至484、SEQ ID NO:6的氨基酸I至483、SEQ ID NO:7的氨基酸I至485、SEQ IDNO:8的氨基酸I至485、SEQ ID NO:9的氨基酸I至485、SEQ ID NO: 10的氨基酸I至485、SEQ ID NO: 11 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO: 12 的氨基酸 I 至 480、SEQ ID NO: 13 的氨基酸I至483或SEQ ID NO: 14的氨基酸I至481，并且其中该变体具有α -淀粉酶活性。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。本专利技术还涉及本专利技术的变体的用途并且涉及一种生产液化淀粉的方法以及一种生产发酵产物的方法。附图简要说明图1示出具有以下氨基酸序列的α -淀粉酶的比对:SEQ ID NO:1是地衣芽孢杆菌α -淀粉酶。SEQ ID Ν0:2是嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶。SEQ ID NO: 3 是在应用微生物学杂志(J.Appl.Microbiology)，1997，82:325-334(SffALL:q59222)中描述的芽孢杆菌α -淀粉酶TS-23。SEQ ID NO:4 是在 W02005/001064 中描述的黄热芽孢杆菌(Bacillusf Iavothermus ) α -淀粉酶 ΑΜΥ1048。SEQ ID Ν0:5是在W004/113511中描述为SEQ ID NO: 21的芽孢杆菌α -淀粉酶TS-22。 SEQ ID NO:6 是解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) α -淀粉酶。SEQ ID NO: 7是在W095/26397中描述为SEQ ID NOl的芽孢杆菌碱性属种SP690淀粉酶。SEQ ID NO:8 是在 W095/26397 中描述为 SEQ ID Ν02 的盐敏芽孢杆菌(Bacillushalmapalus) α -淀粉酶。SEQ ID NO:9是在W000/60060中描述为SEQ ID Ν04的芽孢杆菌碱性属种ΑΑ560淀粉酶。SEQ ID NO: 10是在W0200210356中描述为SEQ ID Ν02的芽孢杆菌碱性属种Α7-7淀粉酶。SEQ ID NO: 11是在冢本高(Tsukamoto)等人，1988，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.) 151:25-33)中描述的芽抱杆菌喊性属种SP707淀粉酶。SEQ ID NO: 12是在EP1022334中描述为SEQ ID N02的芽孢杆菌碱性属种K-38淀粉酶。SEQ ID NO: 13 是在李(Lee)等人，2006，生物化学杂志(J.Biochem)，139:997-1005中描述的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。SEQ ID NO: 14是以前在例如W02002/010355中披露的变体α -淀粉酶LE399。定义等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异是通过突变自然地引起，并且可能在群体内导致多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。α -淀粉酶:α -淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他线性以及分支1，4糖苷键低聚糖以及多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可根据在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定来确定。在一方面，本专利技术的变体具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的α -淀粉酶活性。在另一方面，本申请的变体具有其亲本的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的α -淀粉酶活性。cDNA:术语“cDNA”意指可以通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:1的位置185的位置处用脯氨酸进行的取代并且进一步包括在对应于SEQ ID NO:1的位置15、48、49、50、107、116、133、138、156、176、181、187、188、190、197、201、205、209、213、239、241、255、264、299、360、375、416、437、474以及475的一个或多个位置处的取代，其中该变体与以下各项具有至少60%并且小于100%的序列一致性：(i)SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中的任何一个的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483、SEQ ID NO:2的氨基酸1至483、SEQ ID NO:3的氨基酸1至485、SEQ ID NO:4的氨基酸1至482、SEQ ID NO:5的氨基酸1至484、SEQ ID NO:6的氨基酸1至483、SEQ ID NO:7的氨基酸1至485、SEQ ID NO:8的氨基酸1至485、SEQ ID NO:9的氨基酸1至485、SEQ ID NO:10的氨基酸1至485、SEQ ID NO:11的氨基酸1至485、SEQ ID NO:12的氨基酸1至480、SEQ ID NO:13的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481，并且其中该变体具有α‑淀粉酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C安德森，SE拉森，EP弗里斯，PK汉森，H弗里斯马德森，A维克索尼尔森，PO米歇尔森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK