本发明专利技术提供了一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用，该表达系统含有尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌AU-0501，保藏编号为CGMCC?No.7013。本发明专利技术提供的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌具有突变位点明确、回复突变率低、遗传稳定性好、生物表达量高等优势，在基因工程疫苗的研究和生产中作用重大，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产量更高、成本低的优点。本发明专利技术还提供了应用于该汉逊酵母表达系统的表达载体及其构建方法。本发明专利技术的表达载体可以实现同时共表达两个或多个基因。两个目的基因在汉逊酵母营养缺陷型细胞中可以无干扰地高水平表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种汉逊酵母表达系统，进一步还涉及该汉逊酵母表达系统的构建方法及其应用。
技术介绍
酵母菌作为低等的单细胞真核微生物，既具有原核生物生长快、遗传操作简单的特点，又具有真核生物的翻译后加工和修饰功能，是生产真核生物活性蛋白较为理想的表达系统。酿酒酵母作为第一个表达外源基因的真核系统，应用至今已有三十多年了，大量的蛋白都得到了成功表达。但这一表达系统在工业化生产中存在着诸多不足，如菌株不稳定、外源基因表达水平不高、产量和分泌效率低、蛋白过度糖基化等。甲醇营养型酵母(简称甲醇酵母)是最近二十年逐渐发展起来 的一类表达真核生物基因的较为理想的系统。这类酵母能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长。这类酵母主要包括假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、汉逊酵母(Hanseaula)和毕赤酵母(Pichia)。汉逊酵母是这类酵母中的佼佼者，是目前国际上公认的最为理想的高效表达外源基因的真核表达系统，与其他酵母相比具有独特的优势I)可以利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子实现外源基因的高效表达；2)重组质粒多以非同源重组的方式高拷贝整合于染色体上，较易获得高拷贝高表达的重组菌株；3)表达的外源蛋白贮存在过氧化物酶体里，可使其免受菌体内的蛋白酶降解；4)外源蛋白基因遗传稳定性好，不易丢失；5)外源蛋白即可在胞内表达又可进行分泌表达；6)能在廉价的合成或半合成培养基上进行高密度发酵，易放大，生产成本低，产物易分离纯化。汉逊酵母是一种优于大肠杆菌和其他酵母菌的外源基因表达系统，近年来已有大量难以高效表达的外源蛋白在汉逊酵母表达系统中都得已成功表达。有效的汉逊酵母表达系统包括两个元件能够启动外源基因高效表达的载体系统和具有特殊筛选标记的宿主菌。汉逊酵母菌作为理想的外源基因表达宿主菌，需要不同种类的筛选标记，筛选标记主要包括如下两类一类为营养缺陷型选择标记，如URA3、LEU2、HIS4等标志基因，标志基因发生缺失的宿主菌只能在完全培养基中生长，而不能在选择培养基中生长，只有带有筛选标记的重组表达载体整合到宿主菌后，才能使宿主菌在选择培养基中生长；另外一类为显性选择标记，如抗G418、抗Zeocin的基因等。目前获得的营养缺陷型酵母菌的方法大部分都是通过化学诱变、杂交或原生质体融合等的传统方法获得的相应选择标记，这些方法存在许多明显的缺点，例如大部分为单点突变，易回复突变、存在多重突变效应、突变位点不明确、遗传稳定性差、难以获得较为理想的菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种汉逊酵母表达系统；本专利技术的另一目的在于提供该汉逊酵母表达系统的构建方法及其应用。本专利技术首先提供了一株多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) AU-0501,其为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCCNo.7013。本专利技术使用的ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞为多型汉逊酵母AU-0501，其保藏编号为CGMCC No. 7013，已于2012年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏,分类命名为多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。本专利技术提供了多型汉逊酵母菌AU-0501在生产外源蛋白中的应用。本专利技术提供了含有多型汉逊酵母菌AU-0501的汉逊酵母表达系统。本专利技术提供了一种构建尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤(I)以汉逊酵母野生型宿主菌基因组DNA为模板，分别以引物Pl和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pastoris表达载体pPIC9K为·模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段；所述引物ΡΓΡ6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示；(2)将上述三个基因片段进行纯化，以纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段为模板，以引物Pl和P6进行PCR扩增获得U5’ -G418-U3’基因片段，将纯化获得U5’ -G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母野生型宿主细胞中，U5’ -G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母野生型宿主细胞中；(3)将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37°C培养箱培养至长出菌落；挑选菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37°C培养箱培养，挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主细胞。进一步地，步骤(2)中，Ura3基因的阻断通过同源重组的方式，在乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的第396-546位处插入G418抗性基因，从而获得乳清酸苷_5_磷酸脱羧酶基因共计150个核苷酸缺失的营养缺陷型汉逊酵母菌。在本专利技术的一个实施例中，所用的汉逊酵母野生型宿主菌为汉逊酵母ATCC26012。本专利技术提供了一种应用于汉逊酵母表达系统启动外源基因表达的载体，其为PMV-05，其含有启动子Μ0Χ-Ρ、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColEl复制子、Amp抗性基因。表达载体PMV-05，通过如下方法制备获得(I)以汉逊酵母基因组DNA为模板，分别以引物MOXP-F、MOXP-R ;M0XT_F、MOXT-R ；HARS-F、HARS-R (见 SEQ ID NO. 8) ;Ura3_F、Ura3_R 进行 PCR 扩增，获得基因 MOXP、MOXT、HARS、Ura3 ;上述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3 10所示；(2)以 PBR-SK 质粒为模板，以引物 Amp+ColEl-F、Amp+ColEl-R 进行 PCR 扩增，获得基因Amp+ColEl，上述引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1Γ12所示；(3)将以上5个基因片段纯化，取纯化好的Μ0ΧΡ、MOXT基因片段作为模板，以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段；分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColEl基因片段各I μ I作为模板，以引物HARS-R和Amp+ColEl-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColEl 基因片段；将基因片段 M0XP+M0XT、HARS+Ura3+Amp+ColEl 进行纯化，将纯化好的基因片段M0XP+M0XT、HARS+Ura3+Amp+ColEl用Sac1、SalI分别进行双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，连接，将连接后的重组表达载体转化感受态细胞中，转化克隆筛选得到重组表达载体PMV-05。表达载体PMV-05能够在表达外源蛋白中发挥作用。表达载体PMV-05能够在合适的宿主细胞中成功表达HPV LI蛋白(16、18、31、33、52、58)及EV71 (Pl和3CD基因共表达)、乙肝(HBs本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株多型汉逊酵母菌（Hansenula?polymorpha）AU?0501，其为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷?5?磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCC?No.7013。
【技术特征摘要】
1.一株多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) AU-0501,其为尿卩密唳缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCC No. 7013。2.权利要求1所述的多型汉逊酵母菌AU-0501在生产外源蛋白中的应用。3.含有权利要求1所述多型汉逊酵母菌AU-0501的汉逊酵母表达系统。4.一种构建尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 Cl)以汉逊酵母野生型宿主菌基因组DNA为模板，分别以引物Pl和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pas tor is表达载体pPIC9K为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段；所述引物ΡΓΡ6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示； (2)将上述三个基因片段进行纯化，以纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段为模板，以引物Pl和P6进行PCR扩增获得U5，-G418-U3’基因片段，将纯化获得U5’ -G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母野生型宿主细胞中，U5’ -G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母野生型宿主细胞中； (3)将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37°C培养箱培养至长出菌落；挑选菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37°C培养箱培养，挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主细胞。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述汉逊酵母野生型宿主菌为汉逊酵母ATCC26012。6.一种应用于汉逊酵母表达系统启动外源基因表达的载体，其为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColEl复制子、A...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾美荣，宋琳琳，孟凡童，戚治国，张凯泉，魏文进，刘建凯，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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