一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术提供了一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用，该表达系统含有尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌AU-0501，保藏编号为CGMCC?No.7013。本发明专利技术提供的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌具有突变位点明确、回复突变率低、遗传稳定性好、生物表达量高等优势，在基因工程疫苗的研究和生产中作用重大，相对于目前采用的其他真核表达系统具有产量更高、成本低的优点。本发明专利技术还提供了应用于该汉逊酵母表达系统的表达载体及其构建方法。本发明专利技术的表达载体可以实现同时共表达两个或多个基因。两个目的基因在汉逊酵母营养缺陷型细胞中可以无干扰地高水平表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种汉逊酵母表达系统，进一步还涉及该汉逊酵母表达系统的构建方法及其应用。
技术介绍
酵母菌作为低等的单细胞真核微生物，既具有原核生物生长快、遗传操作简单的特点，又具有真核生物的翻译后加工和修饰功能，是生产真核生物活性蛋白较为理想的表达系统。酿酒酵母作为第一个表达外源基因的真核系统，应用至今已有三十多年了，大量的蛋白都得到了成功表达。但这一表达系统在工业化生产中存在着诸多不足，如菌株不稳定、外源基因表达水平不高、产量和分泌效率低、蛋白过度糖基化等。甲醇营养型酵母(简称甲醇酵母)是最近二十年逐渐发展起来 的一类表达真核生物基因的较为理想的系统。这类酵母能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长。这类酵母主要包括假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、汉逊酵母(Hanseaula)和毕赤酵母(Pichia)。汉逊酵母是这类酵母中的佼佼者，是目前国际上公认的最为理想的高效表达外源基因的真核表达系统，与其他酵母相比具有独特的优势I)可以利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子实现外源基因的高效表达；2)重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株多型汉逊酵母菌（Hansenula?polymorpha）AU?0501，其为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷?5?磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCC?No.7013。

【技术特征摘要】
1.一株多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha) AU-0501,其为尿卩密唳缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCC No. 7013。2.权利要求1所述的多型汉逊酵母菌AU-0501在生产外源蛋白中的应用。3.含有权利要求1所述多型汉逊酵母菌AU-0501的汉逊酵母表达系统。4.一种构建尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 Cl)以汉逊酵母野生型宿主菌基因组DNA为模板，分别以引物Pl和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pas tor is表达载体pPIC9K为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段；所述引物ΡΓΡ6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示； (2)将上述三个基因片段进行纯化，以纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段为模板，以引物Pl和P6进行PCR扩增获得U5，-G418-U3’基因片段，将纯化获得U5’ -G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母野生型宿主细胞中，U5’ -G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母野生型宿主细胞中； (3)将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37°C培养箱培养至长出菌落；挑选菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37°C培养箱培养，挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主细胞。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述汉逊酵母野生型宿主菌为汉逊酵母ATCC26012。6.一种应用于汉逊酵母表达系统启动外源基因表达的载体，其为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColEl复制子、A...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾美荣，宋琳琳，孟凡童，戚治国，张凯泉，魏文进，刘建凯，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：