库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802及其在制备姜黄素衍生物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802?及在制备姜黄素衍生物中的应用，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期2012年9月24日，保藏编号CCTCC?M?2012373；本发明专利技术提供了一株生物转化制备姜黄素衍生物的新菌株--库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802，利用该菌株静息细胞转化方法对姜黄素进行结构修饰，由此获得相应的衍生物；姜黄素结构修饰物的药理或生物活性较修饰前的姜黄素底物有不同程度的改善，有利于药物新制剂的开发；本发明专利技术采用微生物转化方法获得姜黄素衍生物的工艺较简单，环境友好，生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉。

【技术实现步骤摘要】
（一）
本专利技术涉及一株新的姜黄素转化菌株----库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii) ZJPH0802，及其在微生物转化制备姜黄素衍生物中的应用。（二）
技术介绍
姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，难溶于水，溶于乙醇、丙二醇等有机溶剂，易溶于冰醋酸和碱性溶液，在碱性时呈红褐色，在中性和酸性时呈黄色，是一种疏水性多酚化合物，有一个特殊的1,7-二芳基庚烷的基本骨架，由两个邻甲基化的酚及一个β-二酮组成，分子式为C21H20O6。其中β-二酮结构有烯醇-酮互变异构，在酸性和中性溶液中主要以酮式(1)结构存在，而在碱性溶液中主要以烯醇式(2)结构稳定存在。姜黄素的化学结构式为：姜黄素具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗癌、抗HIV等生物活性，可用于治疗皮肤病、糖尿病、风湿性关节炎、囊胞性纤维症、艾滋病和多种癌症等，且其分子量小、毒性低，具有良好的临床应用潜力。但姜黄素的水溶性差、结构不稳定，使其在食品和医药领域中的应用受到限制，其选择性低、药效不持久、被机体吸收的能力差，导致其生物利用度低，这些不足限制了其临床应用。目前许多学者合成了较多的姜黄素衍生物与类似物，并对它们的理化性质和生物活性进行检测和评价，但利用微生物细胞转化方法对姜黄素进行结构修饰的报道较少。Xing Zhang等 采用在华根霉(Rhizopus chinensis)培养液中直接加入姜黄素的生长培养转化法得到姜黄素衍生物（Biocatalysis and Biotransformation, September–December 2010; 28(5–6): 380–386)。本发明采用库德里阿兹威毕赤酵母静息细胞转化方法，不仅有效提高了转化率，还可有效地控制转化液的组成，以适应底物转化的最佳条件；同时减少培养基成分对生物转化过程的影响，便于转化产物的后续分离与提纯。本专利技术的菌种易培养，含酶源细胞的制备成本低，并且姜黄素底物的转化反应时间可大大缩短。采用生物转化法进行天然产物的结构修饰具有选择性好、特异性强等优点，且生物体系可产生多种性质与功能各异的酶，从而可催化姜黄素底物转化生成具有不同取代方式的系列衍生物，有望从中找到活性更好或具有新结构的化合物，对于研究此类化合物的“构效关系”具有重要意义。（三）
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株新的姜黄素微生物转化菌株-----库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) ZJPH0802，以及利用该菌株转化制备姜黄素衍生物的方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新的姜黄素微生物转化菌株-----库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802 (Pichia kudriavzevii ZJPH0802)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期：2012年9月24日，保藏编号：CCTCC M 2012373。菌种来源：库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) ZJPH0802菌株系从采自杭州市浙江工业大学（朝晖校区）土样中分离筛选获得。所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) ZJPH0802按如下步骤筛选获得：土样采集→平板培养→菌种分离→斜面培养→种子培养→ 发酵培养 →生物转化反应→液相色谱检测产物→获得目的菌株所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802菌株的特征如下：菌落形态：麦芽汁平板上30℃培养48 h，菌落呈不规则形状，乳白色，表面干燥，粗糙，疏松，扁平，边缘呈锯齿状。细胞形态：卵圆型或香肠型、周边出芽，有假菌丝，1~2个子囊孢子。生理生化特征：可以利用的碳源有：D-葡萄糖、L-乳酸、琥珀酸、乙醇。不能利用的碳源有：D-木糖、L-阿拉伯糖、松三糖、麦芽糖、淀粉、木糖醇、纤维二糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、水杨苷、L-山梨糖。可以利用的氮源有：L-赖氨酸、乙胺。不能利用的氮源有：硝酸盐、亚硝酸盐、肌酸、肌酸酐。鉴定：该菌种的26S rDNA D1/D2区序列特性：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通过引物NL1和NL4扩增菌株的26S rDNA D1/D2区的基因，再将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) ZJPH0802的26S rDNA D1/D2区序列如下：GCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAATCGTGCTTTGCGGCACGAGTTGTAGATTGCAGGTTGGAGTCTGTGTGGAAGGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGCGCCCAGGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGATGCCGGCGGAAGCAGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCCAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGCGCCCGACATGGGGATTGCGCACCGCTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGCTTTCCCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGCAGGAGAAGGGGTTCTGGAACGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCAGGGCCAGATGCTGCGTGCGGGGACCGAGGACTGCGGCCGTGTAGGTCACGGATGCTGGCAGAACGGCGCAACACCGCCCGTC该序列已提交GenBank（GenBank登录号为No．KC143811），将ZJPH0802菌株的26S rDNA D1/D2区序列在 NCBI 网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行同源性比对（BLAST），结果表明：ZJPH0802菌株与毕赤酵母属（Pichia sp.）的部分菌株序列同源性较高。ZJPH0802菌株与Pichia kudriavzevii DMic 113897菌株（GenBank登录号为No．JN032661.1）的序列同源性达到100%。根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
库德里阿兹威毕赤酵母？(Pichia？kudriavzevii)？ZJPH0802，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期2012年9月24日，保藏编号CCTCC？M？2012373。

【技术特征摘要】
1.库德里阿兹威毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii) ZJPH0802，保藏
于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期
2012年9月24日，保藏编号CCTCC M 2012373。
2.一种权利要求1所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制备姜
黄素衍生物中的应用，其特征在于所述的应用为：以库德里阿兹威毕
赤酵母ZJPH0802发酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于
磷酸缓冲液介质中进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行后处
理，获得所述姜黄素衍生物。
3.如权利要求2所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制备姜黄
素衍生物中的应用，其特征在于所述磷酸缓冲液为pH值5.8~8.0磷酸缓
冲液。
4.如权利要求2所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制备姜黄
素衍生物中的应用，其特征在于所述转化反应液的后处理方法为：反
应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压
蒸馏除去乙酸乙酯，取残留物进行硅胶柱层析，TLC跟踪检测，收集R
f值为0.424或0.712时的洗脱液，蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物。
5.如权利要求2所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制备姜黄
素衍生物中的应用，其特征在于所述的应用为：在酶源，姜黄素，磷
酸缓冲液构成的转化体系中，以库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802发酵
培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值为5.8~8.0磷酸缓
冲液的转化体系中，在20~40℃、150~220 rpm条件下进行转化反应，
反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减
压蒸馏除去乙酸乙酯，取残留物进行硅胶柱层析，TLC跟踪检测，收集
Rf值为0.424或0.712时的洗脱液，蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物
。
6.如权利要求5所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制备

\t姜黄素衍生物中的应用，其特征在于所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH
0802发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为20~150 g/L转化体
系，所述姜黄素底物的初始浓度为20~250 mg/L转化体系。
7.如权利要求5所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制备姜黄
素衍生物中的应用，其特征在于所述于pH值为5.8~8.0磷酸缓冲液的转
化体系中，在30℃、200 rpm条件下进行转化反应，转化反应时间为
16 h。
8.如权利要求2~7之一所述库德里阿兹威毕赤酵母ZJPH0802在生物转化制
备姜黄素衍生物中的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备： 
（1）斜面培养：将库德里阿兹威毕...

【专利技术属性】
技术研发人员：王普，张维宇，黄金，李军，何秀娟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：