7S大豆抗原蛋白注射液及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种7S大豆抗原蛋白注射液，按照体积百分比计，其包括以下组分：纯化后的7S大豆抗原蛋白40%~60%，氢氧化铝胶体40%~60%。其制备方法包括：将7S大豆抗原蛋白纯化，以AlCl3、NaOH通过沉淀法获得氢氧化铝胶体，将化后的7S大豆抗原蛋白、氢氧化铝胶体混匀乳化后获得7S大豆抗原蛋白注射液。本发明专利技术的优点在于，具有针对性强，缓释性高，效果显著等特点，可用于预防临床上动物对大豆及其饲料的食入性过敏问题，有望解决豆制品的食入性过敏带来的危害。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种7S大豆抗原蛋白注射液及其制备方法。
技术介绍
大豆在我国普遍种植，具有价格便宜，蛋白质含量高等特点，是畜禽业生产中最主要的蛋白质来源。然而，大豆中存在的抗原蛋白物质能引起人和动物尤其是在婴幼儿和幼龄动物中引发过敏反应导致腹泻甚至死亡，造成重大的损失。据报道，β_伴大豆球蛋白(β -Conglycinin)和大豆球蛋白(Glycinin)是引起动物致敏的主要成分，分布于大豆种子的子叶中。β_伴大豆球蛋白，简称7S蛋白，是由非共价键形成稳定的三聚体糖蛋白，相对分子量为180 kD，含α，α’和β三个亚基。大豆球蛋白，简称IlS蛋白，分子量为350KD,由6个亚基组成，每个亚基由一个酸性肽链和一个碱性肽链通过一个二硫键连接起来。这两种组分约占大豆蛋白的70%左右，是引起过敏反应的主要抗原蛋白，也是国内外学者对食源性过敏反应的主要研究对象。目前，大多研究使用膨化、热乙醇变性法、热加工法等处理方法，使致敏因子变性失活；或通过改善酶的作用条件，优化酶制剂的组合，利用外源酶对7S大豆抗原蛋白进行酶解从而去除抗原蛋白；或使用蛋白质糖基化工程对蛋白质表面的糖链进行改造，来改良 蛋白质性质；或利用基因敲除的方法使某些基因无法表达，从而消除大豆中的致敏因子。这些方法不能完全去除致敏物质，而且去除条件要求高，成本增力口，虽然有新品种培育出，但需要复杂的食品安全评估过程和农业推广问题，导致其无法在生产实践中得到广泛应用。因此实现从动物体的过敏反应出发，探索出一种可以保护动物免受7S大豆抗原蛋白物质危害的方法，不但能够减少经济损失，而且可以有效的控制该病的发生，具有长远的社会效益。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种7S大豆抗原蛋白注射液。本专利技术是通过以下技术方案来实现的。一种7S大豆抗原蛋白注射液，按照体积百分比计，其包括以下组分纯化后的7S大豆抗原蛋白40% 60%，氢氧化铝胶体40% 60%。进一步地，按照体积百分比计，其包括以下组分纯化后的7S大豆抗原蛋白50%，氢氧化招胶体50%。—种制备上述7S大豆抗原蛋白注射液的方法，包括步骤将7S蛋白纯化，以A1C13、NaOH通过沉淀法获得氢氧化铝胶体，将纯化后的7S大豆抗原蛋白、氢氧化铝胶体混匀乳化后获得7S大豆抗原蛋白注射液。进一步地，上述7S蛋白的纯化包括将7S蛋白溶于pH不小于7. 4的磷酸盐缓冲液，凝胶过滤，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析得纯化的7S大豆抗原蛋白。进一步地，上述氢氧化铝胶体获得包括无水AlCl3加入到去离子水中，与适量NaOH反应，沉淀用去离子水反复洗涤若干次，离心得到氢氧化铝胶体。进一步地，上述氢氧化铝胶体获得后11(T120 °C灭菌2(T40 min。进一步地，上述7S大豆抗原蛋白、氢氧化铝胶体混匀先用涡旋机混匀，再超声混匀。本专利技术的有益效果(I)本专利技术能有效预防动物对大豆及其饲料的食入性过敏，解决了动物对7S蛋白食入性过敏的危害。(2)具有较好的稳定性和水溶性无需苛刻的储存条件，使用方便。(3)制备工艺简单可行，已具备扩大生产的条件和技术，更易实现产品化。(4)简单易行，操作方便，利于推广。总之，本专利技术的7S大豆抗原蛋白注射液具有针对性强，缓释性高，效果显著等特点，可用于预防临床上动物对大豆及其饲料的食入性过敏问题，有望解决豆制品的食入性过敏带来的危害。本专利技术具有制备方法简单，便于储存，便于操作，易于工业化生产等优点。具体实施方式 下面根据实施例对本专利技术作进一步详细说明。总体而言，本专利技术的7S大豆抗原蛋白注射液的制备包括 (I)抗原的纯化及纯度分析纯化将7S蛋白溶于pH为7. 4的磷酸盐缓冲液，Sepharose CL-6B凝胶过滤(1. 6 X 120 cm层析柱)，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析得7S蛋白，储存于_20°C作为抗原备用。纯度分析将胶板上好并安装在电泳槽中，分别取10 μ 标准(样品)蛋白溶解液于EP管内，再加入10 μ 2倍样品缓冲液，上样量为10 μ 。加样前，样品在沸水中加热3飞min，冷却后备用。根据目的抗原蛋白亚基的分子量大小，选择分离胶和浓缩胶的浓度为5%的凝胶。将胶液沿着玻璃板倒入两板之间的夹缝至离上板口约1.50 cm处，在分离胶溶液上覆盖一层f 5 mm的水层用于消泡和密封。静止放置(45飞O min)待其凝固。蒸馏水冲洗胶面，用吸水纸将胶面吸干。倒好胶后，插好梳子，使梳子孔中无气泡。上样及电泳上样量分别为10 PL，浓缩胶的电压为55 80 V，电流为16 18 mA，电泳时间1.5 h，分离胶的电压为10(Γ125 V，电流为3(T35 mA,电泳时间4 h。染色和脱色电泳结束后，撤下胶板切去浓缩胶，轻轻揭下凝胶；37 1以上温度，在固定液漂洗20 min;弃去固定液，放入适量新鲜染色液染色45 min。倾去染色液,用自来水漂洗直到水流无颜色为止,倒入适量脱色液进行脱色，每隔1. 5 h换一次脱色液,直至蛋白亚基条带显色清晰。用Quantity One软件，用光密度法分析SDS电泳图片，并计算其纯度为90.0%。(2)佐剂制备采用5种不同的佐剂(弗氏佐剂、白油、氢氧化铝、PBS、蜂胶)，其中I种佐剂为本专利技术的氢氧化铝胶体，另外4种做对比。(具体见实施例f 5)(3)乳化抗原蛋白取O. 5 mL的抗原液加入等体积的佐剂(弗氏佐剂、白油、氢氧化铝、PBS、蜂胶)，放置在1. 5 mL的EP管中，先用涡旋机混匀，再超声混匀，乳化完成后，4 °C冷藏保存。(4)抗原蛋白注射液检验a.乳化完全性试验取I滴乳化液滴在一杯清水里，看此液滴是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则还要继续乳化。乳化完成后，37 °C室温保存。b.稳定性试验室温37°C保存一个月，底部有微量水析出，摇匀后再放置一周，没有出现分层和破乳的现象。c.无菌检验将制备好的注射液接种至营养肉汤中，37 °C培养18 24 h后再接种至营养琼脂斜面，37 °C培养48 72 h，同时取佐剂同法操作，作为阴性对照。结果判定营养肉汤清亮透明，营养琼脂斜面无菌落生长。d.刺激性试验和热原性试验选取健康家兔5只，一侧后肢股四头肌内分别注射蛋白注射液I mL，另一侧后肢对应部位注射生理盐水I mL作为对照，发现眼和结膜、呼吸、饮食、行为活动均表现正常，未见有任何中毒症状和死亡，与对照组比较无差别；48 h后将家兔处死，解剖观察家兔腿部肌肉，其肌肉完整、无充血现象。注射该注射液的家兔并没有出现热原性反应，家兔体温正常。e.小鼠试用试验及佐剂筛选采用完全随机化，将260只昆明鼠(20±2 g)随机分为弗氏佐剂处理组、白油佐剂处理组、氢氧化铝佐剂处理组、PBS佐剂处理组、蜂胶佐剂处理组，对照组注射生理盐水，处理组使用不同佐剂7S大豆抗原蛋白注射液，每个处理组按体重分别注射7S大豆抗原蛋白量为 500 μδ · Kg^1UOOO Pg*Kg'2000 Pg*Kg'3000 Pg · Kg-1 和 4000 Pg · Kg' 首次免疫，取混合乳化后大豆抗原 蛋白，于小鼠颈背部皮下注射。10 d后，同样方法注射相应抗原组分(弗氏完全佐剂蛋白抗原注射液替换为弗氏不完全佐剂抗原蛋白注射液)，连续10 d后重复I次，第三次注射本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种7S大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，按照体积百分比计，其包括以下组分：纯化后的大豆抗原蛋白40%~60%，氢氧化铝胶体40%~60%。

【技术特征摘要】
1.一种7S大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，按照体积百分比计，其包括以下组分纯化后的大豆抗原蛋白40% 60%，氢氧化铝胶体40% 60%。2.根据权利要求1所述的7S大豆抗原蛋白注射液，其特征在于，按照体积百分比计，其包括以下组分纯化后的7S大豆抗原蛋白50%，氢氧化铝胶体50%。3.一种制备权利要求1所述7S大豆抗原蛋白注射液的方法，其特征在于，包括步骤 将7S蛋白纯化，以A1C13、NaOH通过沉淀法获得氢氧化铝胶体，将化后的7S大豆抗原蛋白、氢氧化铝胶体混匀乳化后获得7S大豆抗原蛋白注射液。4.根据权利要求3所述的7S大豆抗原蛋白注射液的制备方法，其特征在于，所述7S蛋白的纯化包...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金节，寇亚楠，孙志阔，王希春，马良友，徐述亮，陈亮，王勇，樊海新，李宝，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：