获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性β-1,3-1,4-葡聚糖酶技术

本发明专利技术公开了一种获得定向突变基因的方法和基于其发现的β-1，3-1，4-葡聚糖酶。本发明专利技术提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)将序列1自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；(b)将序列1所示的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个：(I)将序列表的序列1自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G；(II)将序列表的序列1自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G；(III)将序列表的序列1自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。本发明专利技术为β-葡聚糖酶的蛋白质工程改造提供了重要方法，也为酸性β-葡聚糖酶的工业应用提供了重要基因资源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性￠-1,3-1,4-葡聚糖酶。
技术介绍
^ -葡聚糖是由葡萄糖通过P -糖苷键聚合在一起形成的高分子聚合多糖，是自然界中含量最丰富的聚糖。￠-1,3-1,4-葡聚糖是自然合成的多聚糖，与阿拉伯木聚糖、戊聚糖、纤维素、果胶等均属高等植物(尤其是禾本植物)细胞壁中的结构性非淀粉多糖。从结构上看，它主要由葡萄糖残基通过￠-1,3和(或)￠-1,4糖苷键连接而成。￠-1,3-1，4_葡聚糖是由葡萄糖以P构型通过￠-1,3-和￠-1,4-混合键形成的直链聚糖。葡聚糖酶是一类能降解谷物中￠-葡聚糖的水解酶类的总称。包括内切和外切￠-1,3 葡聚糖酶(EC 3. 2.1. 39 ；EC 3.2.1.58)、P _1，3 (4)-葡聚糖酶(EC 3. 2.1. 6)、内切和外切 3-1，4_ 葡聚糖酶(EC 3. 2.1. 4 ；EC 3. 2.1. 74) (Boyce et al. Applied Microbiologyand Biotechnology，2007，76 :835-841 ;McCarthy et al.1nternational journal ofbiological macromolecules, 2003, 33 :141-148)。工业用￠-葡聚糖酶主要来源于微生物。迄今，报道的微生物￠-1,3-1, 4-葡聚糖酶大多属于糖苷水解酶16家族，包括细菌、真菌和瘤胃微生物，微生物产生的￠-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿造业和饲料工业中具有十分重要的应用价值。其中，耐热￠-葡聚糖酶在工业应用中具有更高的价值。￠-葡聚糖酶应用于啤酒工业中，可降低麦汁黏度，改善过滤性能，提闻过滤速度，改善麦汁清売度；提闻糖化生广能力，促进可发酵性广物的提闻；提高啤酒的胶体稳定性，清除因3 -葡聚糖引起的冷浑浊；提高滤酒效率，增加批次滤酒量，纯生啤酒生产中可大幅度地提高膜的使用效率，延长膜的使用寿命等。在啤酒工业应用中，3 -葡聚糖酶需在酸性条件下(pH 4. 5-5. 0)作用。另外，由于动物的胃内环境呈酸性，胃内容物到达十二指肠仍显略酸性。因此，对耐热￠-1,3-1,4-葡聚糖酶进行定向进化，开发酸性条件下稳定和高效的耐热P -1,3-1,4-葡聚糖酶对于其在食品、饲料及能源工业中应用具有重要意义。定向进化应用最广泛的两种技术是易错PCR(error prone PCR)和DNA改组(DNAshuffling)。其中易错PCR技术是在体外扩增目的基因时以一定的频率在基因内部引入点突变，由于突变只发生在单一分子内部，属于无性进化。与易错PCR不同，DNA改组技术是利用重叠延伸PCR技术，将已获得的存在于不同基因中的多突变信息随机重组到同一个DNA分子，形成新的基因随机突变库，属于有性进化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性P -1,3-1,4- 葡聚糖酶。本专利技术提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)将序列表中序列I自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；(b)将序列表中序列I所不的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个(I)将序列表的序列I自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G ；(II)将序列表的序列I自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G ；(III)将序列表的序列I自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。所述蛋白质具体可为如下(I)至(8)中任一所述的蛋白质(I)序列表中序列3自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；(2)序列表中序列3所示的蛋白质；(3)序列表中序列5自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；(4)序列表中序列5所不的蛋白质；(5)序列表中序列9自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；(6)序列表中 序列9所不的蛋白质；(7)序列表中序列7自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；(8)序列表中序列7所不的蛋白质。编码所述蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因具体可为如下①至⑧中任一所述的DNA分子①序列表的序列4自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；②序列表中序列4所示的DNA分子；③序列表的序列6自5’末端第55至942位核苷酸所不的DNA分子；④序列表中序列6所示的DNA分子；⑤序列表的序列10自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；⑥序列表中序列10所示的DNA分子；⑦序列表的序列8自5’末端第55至942位核苷酸所不的DNA分子；⑧序列表中序列8所示的DNA分子。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pET_26b (+)载体得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21 (DE3)得到的重组菌。本专利技术还保护一种制备所述蛋白的方法，是发酵培养所述重组菌，得到所述蛋白。所述发酵培养的条件具体可为①将菌株接种至液体LB培养基(含有50ii g/mL卡那霉素)振荡培养(37°C，200rpm)至OD6tltl为0. 6 在步骤①的菌液加入IPTG(使其终浓度为1.OmM)，30°C振荡培养(200rpm) 4h，得到发酵液。本专利技术还保护所述蛋白作为￠-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用。所述应用中，所采用的反应温度可为40-70°C，优选为50-60°C。所述应用中，所采用的反应pH可为4. 0-9. 5，优选为4. 5-7. 5，最优选为5. O、5. 5或6. O。所述应用具体可为，采用所述蛋白降解大麦葡聚糖，获得葡萄糖。本专利技术还保护一种获得定向突变基因的方法，包括如下步骤(I)以野生型蛋白的编码基因为模板，进行易错PCR，得到PCR产物；(2)将步骤⑴的PCR产物进行随机片段化，得到约50bp的DNA片段；(3)将步骤(2)的DNA片段进行拼接重组，得到突变DNA库；(4)将步骤(3)的突变DNA库构建到pET_26b⑴载体上并转化大肠杆菌BL21(DE3)； (5)将步骤⑷得到的重组子进行定向筛选，得到正向重组子；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)将序列表中序列1自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个：(I)将序列表的序列1自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G；(II)将序列表的序列1自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G；(III)将序列表的序列1自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)将序列表中序列I自N末端第19至314位氣基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个(I)将序列表的序列I自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G；(II)将序列表的序列I自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G；(III)将序列表的序列I自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质为如下(I)至(8)中任一所述的蛋白质(I)序列表中序列3自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；(2)序列表中序列3(3)序列表中序列5(4)序列表中序列5(5)序列表中序列9(6)序列表中序列9(7)序列表中序列7(8)序列表中序列7所不的蛋白质；自N末端第19至所不的蛋白质；自N末端第19至所不的蛋白质；自N末端第19至所示的蛋白质。314位氨基酸残基组成的蛋白质； 314位氨基酸残基组成的蛋白质； 314位氨基酸残基组成的蛋白质；3.编码权利要求1或2所述蛋白的基因。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是如下①至⑧中任一所述的DNA 分子①序列表的序列4自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；②序列表中序列4所示的DNA分子；③序列表的序列6自5’末端第55至942位核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，贾会勇，闫巧娟，李一男，陈洲，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：