本发明专利技术公开了一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法，属于生物检测技术领域。一种人星状病毒核苷酸的检测引物，由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如SEQ?NO.1和2所示。与上述检测引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ?NO.3所示；该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。检测人星状病毒核苷酸的方法，包括如下步骤：以待检样品RNA为模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明专利技术根据人星状病毒基因组序列设计的引物特异性好，用于实时荧光RT-PCR检测的灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及。
技术介绍
人星状病毒(Human astrovirus, HAstV)是无包膜的单股正链RNA病毒，属于星状病毒科哺乳动物属。HAstV是导致幼小动物产生腹泻的一种重要病原，世界各地均已有星状病毒感染的报道，既可散发也可以引起暴发流行，亦可引起医源性感染。与轮状病毒相似，星状病毒感染多发生在2岁以内尤其是I岁以内的婴幼儿。目前认为人星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因，仅次于轮状病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群，人类免疫缺陷患者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感 染均已有报道。人星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作方便，可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。1975年Madeley首次在电镜下观察到星状病毒，由于病毒颗粒表面有5 6个星状突起，故而得名。人星状病毒颗粒直径为28 41nm，当病毒存在于高pH值环境下，其表现为典型的星状形态。它的基因组从5’端到3’端包括一个约85个核苷酸的5’非编码区、3个开放读码框架(ORFla、ORFlb, 0RF2)、1个约80个核苷酸的3’非编码区和I个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORFla和ORFlb编码非结构蛋白，ORFla编码丝氨酸蛋白酶，且其下游存在I个核定位信号；0RFlb编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase, RDRP), RDRP是通过核糖体读框移位机制合成的I个融合蛋白。HAstV衣壳蛋白由0RF2编码合成。在病毒复制的过程中，所感染的细胞内可检测出2种病毒特异性的RNA，I个是6. 8KB的全长基因组RNA，另一个是2. 8Kb的亚基因组RNA，2种RNA的3’端均具有多聚腺苷酸尾。亚基因组RNA包含了全部的0RF2序列，可作为mRNA表达衣壳蛋白。0RF2编码产物至少包括2个区域第I个区域(I 415个氨基酸)在各血清型之间是高度保守的;第2个区域(416个氨基酸 结束)是高度变异的，病毒的中和抗原决定簇即在此区域内。人星状病毒在细胞培养中增殖困难，且多数星状病毒在细胞培养物中不产生细胞病变，这为病毒分离带来了难度。目前人星状病毒的常规检测方法主要是应用电镜直接检测粪中的病毒颗粒，或用免疫诊断方法检测粪中的病毒抗原和血清中的特异性抗体。电镜检查病毒灵敏度较低，容易出现漏检；免疫学方法特异性有待提高，而且都费时费力。传统的RT-PCR也被用于人星状病毒，但检测时间需要6小时。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人星状病毒核苷酸的检测引物。本专利技术的另一目的在于提供与上述检测弓丨物配合使用的探针。本专利技术的另一目的在于提供一种检测人星状病毒核苷酸的方法，该方法通过使用上述检测引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒，为人腹泻和胃肠炎的病原学诊断提供科学依据。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种人星状病毒核苷酸的检测引物，所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下正向引物5，-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3，；反向引物5’ -GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3，。与上述检测引物配合使用的探针的核苷酸序列如下探针5’ -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料；优选的，该探针的5’端标记有报告荧光染料,3’端标记有淬灭荧光染料。所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5。所述的淬灭突光染料优选为Tamra、Rox> Dabcyl、BHQl或BHQ2。根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对人星状病毒的检测。一种检测人星状病毒核苷酸的方法，包括如下步骤以待检样品RNA为模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。所述的检测人星状病毒核苷酸的方法的实时荧光RT-PCR反应体系包括如下组分2· 5 μ LlOXOne Step RNA PCR Buffer,2y L dNTP (各 2. 5mM)，上述正向引物和反向引物(10 μ M)各1. 5 μ L，O. 5 μ L 上述探针(10 μ Μ)，O. 5 μ L Taq 酶，O. 5 μ L RNase Inhibitor(40U/y L)，0. 5μ L AMV RTase XL (5U/y L),5y L RNA, 10. 5 μ L RNase Free dH20。当然，可以根据本专利技术给出的引物对或者其扩增产物序列设计其它类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本专利技术根据人星状病毒基因组序列设计的引物特异性好，用于实时荧光RT-PCR检测的灵敏度高。(2)本专利技术检测方法准确性高，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒，为人腹泻、胃肠炎的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。附图说明图1是人星状病毒核酸Real-time RT-PCR检测方法的特异性试验结果图。图2是人星状病毒核酸Real-time RT-PCR检测方法的灵敏性试验结果图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1引物和探针的设计从NCBI数据库下载所有的已知人星状病毒全基因组序列，并进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计引物和探针，其序列如下正向引物5，-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3，；反向引物5，-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3’。探针的序列为5’ -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’ ；该探针的5’端用报告荧光染料VIC标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。 实施例2人星状病毒核酸荧光RT-PCR条件的优化利用灭活的人星状病毒作为待检样品，用商业RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA,分别分装后储存于_20°C备用。(I)引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将实施例1中的引物浓度分别从O.1 μ mol/L至1. 6 μ mol/L作倍比连续稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μπιΟ1/1。(2)镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl2的浓度从lmmol/L至10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人星状病毒核苷酸的检测引物，其特征在于：所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：正向引物：5’?GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC?3’；反向引物：5’?GGACTTGCTAGCCATCACACTTC?3’。
【技术特征摘要】
1.一种人星状病毒核苷酸的检测引物，其特征在于所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下 正向引物5’ -GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’ ； 反向引物5’ -GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3，。2.与权利要求1所述的检测引物配合使用的探针，其特征在于所述探针的核苷酸序列如下5’ -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’ ；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于所述探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于 所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5 ； 所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox, Dab...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖性龙，余以刚，吴晖，李晓凤，唐语谦，袁琨，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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