脂质体的两相制备方法及其在制造诊断试剂中的应用技术

本发明专利技术涉及脂质体的两相制备方法，在其过程中，使用技术上简单和廉价的机械混合方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的单独混合物的非极性有机相和与其不混溶的极性水（缓冲液）相，合成具有独特结构的脂质体乳剂。此外，本发明专利技术包括关于当不使用任何洗涤剂将蛋白类型活性成分锚定到脂质体膜的表面，并且非蛋白类型活性成分与具有独特结构的脂质体乳剂简单混合时，以这种方式制备的脂质体的体外诊断用途的方法的实施方式。在一个可能的方法的实施方式中，制备凝血酶原时间(PT)试剂。在另一个可能的方法的实施方式中，制备激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及脂质体的两相制备方法，在其过程中，使用技术上简单的机械方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的单独混合物的非极性有机相和与其不混溶的极性水(缓冲液)相。当活性组分锚定到脂质体膜的表面时，用本方法制备的具有独特结构的脂质体乳剂优选体外应用。此外，本专利技术可能的实施方式涉及体外血液凝固诊断试剂的制备。在本专利技术的一组实施方式中，所述试剂由我们的提供用于活性组分和蛋白类型的活性组分的膜表面的具有独特结构的脂质体乳剂，即天然或重组组织因子，组成。在这个组的可能的实施方式中， 在初步制备的脂质体上实现将蛋白锚定到膜表面。在这个组进一步可能的实施方式中，蛋白的锚定与脂质体膜表面的组装同时进行。在另一组实施方式中，所述试剂由我们的具有独特结构的脂质体乳剂和与所述乳剂通过简单的机械混合混合的非蛋白类型的可溶活性组分组成。非蛋白类型的可溶活性组分可为有机酸或无机化合物(例如，鞣花酸、鞣酸、芸香苷、槲皮苷或无机二氧化硅)。本专利技术的主题为方法，作为其中可能的实施方式，制备了体外血液凝固诊断试剂。 通过我们的方法制备的所述体外血液凝固诊断试剂适于测量凝血酶原时间和激活部分促凝血酶原激酶时间。本说明书的进一步的主题为上述方法可能的商业实现。
技术介绍
血液凝固诊断中最常用的进行的测量目的为测定凝血酶原时间(PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。两种诊断方法监控血液凝固系统的酶过程，以显示检测的有机体的止血状态。血液凝固是一个由复杂的增多和减少的生化步骤组成的级联型酶链反应。血液凝固系统的酶反应中决定性的多数为包括蛋白和非蛋白类型分子(酶和辅因子)和膜组分的膜结合过程。膜组分的主要构成为起基本结构(锚定)和功能(例如酶活性辅因子)作用的极性和非极 性脂质。为在体外系统中模拟体内膜结合过程，膜功能可被脂质化的特定过程支持，为体内系统提供合适的脂质成分。根据本专利技术，体外血液凝固诊断试剂中含脂质的组分为脂质体，即具有小于微米范围的直径的脂囊泡，其与合适组成的水溶液形成稳定的乳剂。所述脂质体提供体外血液凝固诊断反应所必需环境的膜表面，即它们适于锚定有机化合物(例如具有合适氨基酸序列的天然或重组蛋白)并适于与具有合适结构的有机或无机化合物结合。此外，脂质体膜的表面在锚定的活性蛋白或可溶活性无机化合物的表面活性反应中起到辅因子的作用。PT和APTT测量旨在确定作为血液凝固系统的中心步骤的血浆纤维蛋白原的聚合时间，即非活性凝血素变化为活性凝血酶时间。PT测量利用所谓的促凝血酶原激酶的凝血启动效应，即所谓外在凝血途径的起始 [Mackman N.等，(2007) =Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27 :1687 至 1693]。促凝血酶原激酶包括含在磷脂膜中的组织因子(TF，凝血因子III)。组织因子为与膜重叠的跨膜糖蛋白[Bazan J. F. (1990) :PNAS 87,6934-6938.]。虽然健康个体的循环血液中的组织因子的可检测水平有争议[Monroe D. Μ.，Key N. S. (2007) :J. Thromb. Haemost. 5:1097-1105.]， 当血管床损伤时，膜结合的组织因子由沿损伤的细胞(例如内皮细胞和白细胞)释放，从而启动血液凝固级联反应。释放的膜结合组织因子结合并激活凝血因子VII，因此膜结合组织因子起到激活的凝血因子Vila的辅因子和受体的作用。膜结合组织因子和激活的凝血因子VIIa在Ca2+离子存在下促进凝血因子X的激活。由凝血酶原酶复合体触发凝血素转变为凝血酶，凝血酶原酶复合体由激活的凝血因子X (即因子Xa)和激活的凝血因子V (即因子Va)组装，后者起到调节蛋白的作用。凝血酶将纤维蛋白原蛋白链裂解成纤维蛋白单体。 凝血酶还激活因子XIII ;激活的因子XIIIa形成转谷氨酰胺酶家族的连接酶，起到纤维蛋白的稳定因子的作用。在激活的纤维蛋白稳定因子XIIIa的影响下，通过共价交联由纤维蛋白单体产生纤维蛋白聚合物，即稳定的纤维蛋白网络(Edgington T. S.等，(1991):组织因子的表达和功能的结构生物学，Thrombosis and Haemostasis,66 :67_79)。如上述，促凝血酶原激酶为包含锚定到合适组成的脂质膜的组织因子的膜复合体。此外，与环绕脂质膜结合的蛋白的存在是在时间和空间上血液凝固级联反应的启动中的关键。通过动物 或人富含脂质的内皮组织与水溶液的均匀化，产生绝对多数现有的PT试剂。然而，在一些先进的产品中，应用与人造脂质结构结合的含重组组织因子的促凝血酶原激酶。在APTT测定中，激活级联反应的启动不需要任何组织因子组分(部分促凝血酶原激酶)，但是由具有净负电荷的活性成分(二氧化硅，有机酸)和脂质膜触发。已知用于生产血液凝固诊断试剂的方法在制备膜组分，即脂质体，的方法方面彼此不同。在所有用于生产PT试剂的方法中，通过混合在表面活性剂物质(洗涤剂)的帮助下保存于溶液中的组织因子和预制的脂质体分散体制备促凝血酶原激酶[该方法在美国专利5625036、美国专利5314695、美国专利6124110、美国专利6733985、美国专利7049087 和美国专利7148067中说明]。由于存在的比例大于0. 05%的洗涤剂抑制血液凝固反应， 通过合适的分离方法即透析[参考例如美国专利5314695 ;美国专利4622188 ;美国专利 6124110 ;和美国专利6733985]、超滤[美国专利5625036 ;和美国专利5314695]或吸附方法[如在美国专利7049087 ;和美国专利7148067中说明]，从体系中去除表面活性剂。去除洗涤剂的过程，即当洗涤剂的浓度达到其最终值时，应通过进行几个生产中测定检查。除了增加程序的步骤之外，使用洗涤剂一个很大的缺点为洗涤剂自身和/或用于去除其的步骤的高成本。已知的方法中，用于生产脂质体的方法[例如在美国专利4622188中]基于这样的现象，即在合适极性的溶液中，根据物理化学环境，同时具有极性和非极性分子部分的表面活性物质形成单层或多层囊泡。“A” 一最常使用的用于生产脂质体经典方法为所谓的干膜方法[在美国专利 4438052 ;美国专利5556637 ;和美国专利7169410中说明]。在这个方法中，第一个步骤为将脂质溶于有机溶剂。然后，用真空或惰性气体流将溶剂从溶液中完全蒸发。最终将在容器壁上形成的干脂质膜分散于合适的水溶液中。通过充分混合[例如在美国专利6296870 中说明的方法]和/或超声粉碎[参考美国专利5234634]制备来自该分散体的最终脂质体乳剂。这些已知的方法基本上形成具有相当宽的尺寸分布的多层脂质体。通过在提供窄的粒径分布和单片层或双片层囊泡的高压装置上挤压所述未加工的分散体，可实现合适尺寸分布和优选的迭片结构。挤压方法在九十年代广泛使用[这种方法的实例在美国专利 4529561 ;美国专利5204112 ;和美国专利6926905中说明]。根据所含脂质的溶剂的水混溶性，混合溶剂的方法可分成两类。在使用可与水混溶的溶剂的情况下，所述方法被称为单相方法[一个实例为美国专利 6261792]。“B” 一在单相方法中，脂质溶于极性有机溶剂，通常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种脂质体的两相制备方法，在所述方法的过程中，混合包含天然和合成磷脂混合物的非极性有机相和与所述非极性有机相不混溶的极性水(缓冲液)相，并产生具有50至IOOnm粒径的脂质体乳剂，其特征在于用一种简单的机械方法生产所述脂质体乳剂，其中，用溶于所述非极性有机相中并呈现正曲率或零曲率的O. 5至1. 5g/ml浓度的脂质分子的单独混合物产生完全包围所述有机相的单层或双层脂质体膜的结构，所述脂质分子为例如卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱和更少量的天然来源的其它磷脂，这样，以这种方式制备的具有独特结构的所述脂质体乳剂的所述膜表面优选适于锚定活性成分。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于将2 I比例的氯仿-甲醇混合物用作非极性有机相。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于在所述非极性有机相中，为生产呈现正曲率或零曲率的脂质分子的所述单独混合物，优选提供55°C的温度和pH=2的环境。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于在所述极性水相中，用有机化合物，优选0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸，提供所述缓冲效果。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于用5MNaOH将所述极性水(缓冲液)相的pH值调节在pH=6和pH=7之间、优选pH=6. 6，并以O. 05M的浓度补充抗菌NaN3防腐剂。6.如权利要求1至5的任一项所述的方法，其特征在于在制备所述具有独特结构的脂质体乳剂的过程中，将较小体积的所述非极性有机相加入到较大体积的所述极性水(缓冲液)相中，所述较大体积为所述较小体积的5至50倍大,最优选20倍。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于在室温(25°C)下将相简单摇动到一起，所述相为在所述极性水(缓冲液)相下分层的所述非极性有机相。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于由于搅拌元件的旋转运动，较大体积的所述相在室温被带入涡旋运动，然后将较小体积的所述相注入、喷射或最优选滴入所述涡旋中。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于通过离心旋转所述混合容器将较大体积的所述相在室温带入涡旋运动，然后将较小体积的所述相注入、喷射或最优选滴入所述涡旋。10.如权利要求7至9的任一项所述的方法，其特征在于通过沉降、过滤或离心去除与不与水混溶的所述制造的成品的组分。11.制备体外凝固诊断凝血酶原时间(PT)的试剂的方法，所述试剂的一种成分为用根据权利要求1至10的任一项所述的方法制造的脂质体，其特征在于在制备所述PT试剂的过程中，不使用任何洗涤剂，将蛋白类型的活性组分组织因子锚定到所述具有独特结构的脂质体的所述膜表面。12.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其特征在于所述具有独特结构的脂质体组分在预备生产步骤中生产。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分为从天然来源分离的组织因子。14.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分为通过发酵生产的重组组织因子。15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于所述天然或重组组织因子(活性成分)优选使用O. 5至1. O μ M的浓度。16.如权利要求1至15的任一项所述的方法，其特征在于包含所述具有独特结构的脂质体乳剂的所述溶液与所述天然或重组组织因子(活性成分)混合到一起，并静置优选10分钟。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于所述脂质体乳剂与所述组织因子以2 I的比例混合。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于通过用合适组成的缓冲液稀释来调节通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和组织因子并静置而生产的产品的最终血液凝固特性。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于具有合适组成的缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫·安托，佐尔坦·瓦伊达，舒兹桑纳·陶卡奇，贝亚塔·纳吉，
申请(专利权)人：戴阿冈有限公司，
类型：
国别省市：