本申请公开了用于不同样品的细菌总DNA内含物的特异性分离方法，在所述方法的过程中，裂解所述细胞，选择性结合所述裂解物的DNA内含物，洗涤所述DNA内含物，然后在水溶液中从所述结合表面上洗提所述脱盐的直链聚合核苷酸。在细胞裂解之前，基于非活细菌细胞和活细菌细胞不同的细胞表面的物理-化学特性，将所述非活细菌细胞从所述活细胞中分离，将所述样品的所述活细胞保存然后用机械和/酶的方法裂解，优选溶菌酶的方法。此后，将源自活细胞的所述裂解物的双链DNA专门结合在含有化学激活的-OH和十二烷胺基团的-SiO2-TiO2-基质上，洗涤之后，在水溶液中所述洗提脱盐的直链聚合核苷酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的主题是一种用于不同来源样品的细菌总DNA内含物的特异性分离方法以及一种用于实践中实现该方法的试剂盒。
技术介绍
在饮用水、环境水、食品、工作区、不同的公共和环境表面的公共健康卫生监测方面，所收集样品的微生物测试的重要部分是细菌的定性和定量测定。对于上述测定而言一除了选择性或非选择性培养基上的体外培养和它们的显微检测以外，以及除了为单个细菌新陈代谢步骤而精心进行的生化反应以外一目前多种基于核酸的分子诊断方法也是可行的，例如聚合酶链反应(PCR)核酸序列的体外扩增、或揭示核酸碱基序列的排序方法、或测试所得核酸片段的琼脂糖凝胶电泳方法 与传统方法不同，这些核酸类的分子诊断方法使得分析即使在少量首批样品的情况下也能够进行。这些核酸类的分子诊断方法的模板是具有实际使用的分析方法所需的浓度和纯度的细菌核酸。然而，这两个参数，核酸的浓度和纯度会随着所用的预分析方法而变化，即随着样品破碎和核酸提取的方法而变化。为得到模板核酸的样品破碎为多步骤方法，在该方法中，适合当前用途的单独步骤可以分别进行或彼此结合。通常，破碎始于细胞裂解，接着在随后的步骤中进行选择性结合-靶向脱氧核糖核酸(DNA)的提取和纯化，然后以纯化分离的核酸的定性和定量测定结束方法。在确定合适的PH值、温度和离子条件时，可以机械地(例如通过溶胀、超声破解、粉碎进行破碎)，化学地(例如用含有酶、表面活性剂、洗涤剂、离子螯合剂的缓冲液)，在蛋白改性和细胞内脱氧核糖核酸酶抑制添加剂的联合复合物中，进行破碎。在沉淀-提取、离心、电泳或色谱法的帮助下，可以从破解得到的裂解物中分离并纯化靶向核酸。例如通过测量在紫外波长(UV)诱导的DNA插入聚芳染色(例如溴化乙啶)的荧光发射，可以进行从细胞大分子和进一步的细胞碎片中纯化的核酸产物的半定量分析。在用UV分光光度法在波长λ26(ι处测量的光密度(OD)的基础上，可以进行分离的核酸的定量分析。一个OD单元相当于50 μ g/ml的DNA浓度。为了定义分离的DNA的纯度，使用了在两个不同UV波长处测量的光密度比(OD26tl/OD28tl),即在核酸水溶液和蛋白水溶液的特征波长处(λ 26(|和λ28(ι)测量的光吸收比。优选地，OD260/OD280的比值在I. 4至2. O的范围内变化。较小值显示了蛋白污染(例如细胞裂解物的残留蛋白组分)，而较大值(>2)显示了分光光度测量误差或其他可能的污染。当使用PCR时，优选地0D26Q/0D28Q比应该在I. 4至I. 8之间。在日常的公共健康实践方面，最普遍地是使用苯酚-氯仿混合物分离细菌DNA, MDNA可以用易与水混合的有机溶剂分离，例如用异丙醇分离。上述有机溶剂在破碎和分离的方法中毫无疑问是有效的，但是它们威胁实验室工作人员和环境的潜在毒性却不容忽视。避免使用上述有机溶剂的相当常用的解决方法为，在破坏生物样品之后还向分离基因组DNA内含物的缓冲液体系中加入离液序列高的组分。由于离液序列高的组分使蛋白质改性(例如NaJ、KJ、Na-高氯酸盐、盐酸胍_GC、硫氰酸胍-GTC)以及合适的pH值水平，与蛋白结合的核酸分解，且核酸降解核酸酶的功能性抑制促进了有效的DNA分离。美国专利4900677记载了适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌破碎的方法，之后使用不含有机溶剂的溶液以快速方法将绿脓杆菌和粪链球菌的染色体DNA内含物与其它物质分离。为了提取染色体DNA，在包含具有不同目标光谱的酶(溶解酵素、内-N-乙酰-溶菌酶、消色肽酶等)、溶解剂(例如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺)、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、TritonX-100、CHAPS、CHAPSO)和离子螯合剂(例如EDTA)组分的基于pH=8. O的Tris缓冲液的混合物中，通过涡流混合将初始IO7-IO8细胞团破碎。用核糖核酸酶(RNase)消化污染核糖核酸(RNA)物质，且通过加入蛋白酶K中和剩余的酶蛋白物和非酶蛋白物。向体系中加入支 持DNA分离的离液序列高的组分(例如Na-三氟醋酸盐、Na-高氯酸盐、NaJ)，然后使用火棉胶膜透析纯化将近一小时得到的DNA。通过改变反应温度(37° C和60° C)进一步促进样品破碎和剩余蛋白的中和。根据美国专利5595876，在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的所谓原位单管DNA提取过程中，通过提高温度也可以促进残留蛋白的中和。如上所述，在破碎和分离的过程中成功地避免了有机溶剂的使用，但是提取的产量和分离的DNA纯度却降低了。通过一种间接方法试图提高DNA产量，该方法通过在碱性缓冲介质中(例如pH=8至9)加入少量易与水混合的有机溶剂而促进DNA的选择性分离。在美国专利5945515中，在一个真核细胞实例中，通过加入少量有机溶剂将RNA物质从也在碱性缓冲液中含有离液序列高组分(GTC)的细胞裂解体系中初步沉淀，然后用离心分离沉淀物，从而将要分离的DNA选择性地留在溶液中。在该专利说明书进一步的实例中，为了加快上述DNA分离，在数量上减少然后省略了离心步骤。在分析以此获得DNA的纯度时，还在琼脂糖凝胶电泳法中检测到了 RNA残留污染物。除了以上常规的和间接的分离方法以外，约二十年来，实践中按照不同原理操作的DNA分离的其他替代方法已经变得越来越广泛。实际上，这些替代方法中的一类在生物大分子的分离方面使用了色谱原理。这些方法都是基于原理细胞裂解后，裂解物的DNA物选择性地且可逆地结合在载体表面上。这些载体可以为过滤物(硝基纤维素、尼龙、醋酸纤维素、金属氧化物)、塑料(PVDF)或玻璃(硅胶 Si02、SiO2-TiO2)类的基质,或者可以为通过结合不同离子和聚合物得到的微粒和珠子，在载体的使用过程中，破碎和DNA提取的步骤可以自动进行。WO 专利 2004033707 记载了 Na-硅酸盐载体的使用，WO专利第2004046231号记载了在真核线粒体DNA CmtDNA)或全血DNA内含物的分离过程中，结合到聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯载体(试管、微板孔)的二氧化硅、硅胶的使用。在记载于WO专利1998023630中的单步方法中，羟化的芳香疏水聚合物、聚羟基苯乙烯的作用被描述为保留细胞裂解物的污染组分，同时核酸随着洗提液离开。WO专利2002000930记载了在胍盐 的帮助下，从应用于尼龙或愈疮木浸入的载体的粪便涂片样品中提取DNA，而在美国专利20080319182中通过提供特殊的阳离子表面而确保DNA结合。用可逆的二级结合和对载体的选择性特征，在独特的物理-化学条件(温度、离心力、电解质条件等)下，将包括DNA的核酸结合在这些载体的表面。从溶液中清除具有结合在其表面的DNA的载体后，且在合适的脱盐后，通过从载体洗提DNA可以分离所结合的DNA。对于下游分子应用(例如PCR、酶消化、排序、电泳等)而言，分离的DNA的最重要的参数为纯度(参见下文)、量(浓度μ g/ml)和完整/片段，即分子的物理维持。使用上述有机溶液的常规提取方法的优点是较令人满意的纯度(OD26tlA)D28tl指数=1. 4-1. 7)和较大的浓度(>50 μ g/ml)。其缺点在于残留溶剂会干扰敏感的下游分子应用(例如水解探针定性的实时PCR、微阵列)，还在于分离方法耗时(最少I.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：加博·基斯，亚诺什·基斯，卡塔林·斯通奇克，乔治娜·贝尔纳特，
申请(专利权)人：戴阿冈有限公司，
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