提取楠木RNA的方法技术

本发明专利技术涉及提取楠木RNA的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术所解决的技术问题是提供了一种成本较低的提取楠木RNA的方法。本发明专利技术提取楠木RNA的方法包括如下步骤：按重量份取0.1份楠木叶片，磨成粉，然后加入到0.8～1.5份的预处理液中，再加入0.1～0.3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；b、匀浆液静置1～3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；c、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70～80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及提取楠木RNA的方法，属于生物

技术介绍
楠木为樟科常绿大乔木，分布区位于亚热带常绿阔叶林区西部，气候温暖湿润，年平均温17°C左右，I月平均温7°C左右，年降水量140(Γ1600毫米。国家二级保护渐危种。楠木为我国特有，是驰名中外的珍贵用材树种。四川有天然分布，是组成常绿阔叶林的主要树种。由于历代砍伐利用，致使这一丰富的森林资源近于枯竭。现存林分，多系人工栽培的半自然林和风景保护林，在庙宇、村舍、公园、庭院等处尚有少量的大树，但病虫危害较严重,也相继在衰亡。为了更好地保护濒临灭绝的楠木，需要对楠木的生长环境、栽培育苗、生理指标、 资源分布等进行调查和研究，特别是采用现代分子生物学的手段对楠木RNA进行测序，更有利于楠木的育种研究。楠木RNA主要从楠木叶片中提取得到，楠木叶片富含芳香油(精油)、多糖、多酚类次级代谢产物成分，是楠木总RNA提取和纯化试验中最重要的干扰物质，也为后续的RNA结构和功能、cDNA文库构建、楠木种子萌发以及材质发育相关基因的转录水平研究增加了困难。并且，楠木中RNA含量相对较低，这也是提取纯化试验中的难题。目前，对于RNA的提取方法主要有传统的Trizol以及改良试剂方法，CTAB,Tris-SDS、异硫氰酸胍和皂土试剂等方法，另外，还有一些商业试剂盒等。但是上述方法用于提取楠木RNA时，却存在一些缺陷。传统的Trizol以及改良试剂方法不能获得楠木叶片RNA ;而CTAB、Tris-SDS、异硫氰酸胍和皂土试剂等方法提取的楠木叶片总RNA含量和纯度都很低，不能满足文库构建等研究的需求；使用国内以及国际的商业化试剂盒获得的楠木叶片总RNA纯度高，但较低的RNA含量相对提高了试验费用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种成本较低的提取楠木RNA的方法。本专利技术提取楠木RNA的方法包括如下步骤a、按重量份取O. I份楠木叶片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的预处理液中，再加入O. I O. 3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；其中，所述的预处理液为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2 4wt%，乙二胺四乙酸的浓度为80 UOmmolL-1，β -巯基乙醇的浓度为I. 5 2. 5%ν/ν ；b、匀浆液静置I 3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；c、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。目前的RNA的提取方法一般都是直接进行裂解处理，没有前处理步骤，本专利技术方法通过乙酸乙酯+预处理液处理，可以除去大部分精油脂类、糖类、酚类和色素类杂质，有利于提高楠木RNA纯度。进一步的，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液的温度优选为40 440C。a步骤中所述的预处理液的温度最优选为42°C。其中，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液优选为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3wt%，乙二胺四乙酸的浓度为lOOmmolL—1，β-巯基乙醇的浓度为2%ν/ν。其中，上述方法的C、d、e步骤可以按照常规方法进行。进一步的，为了提高楠木RNA纯度，c步骤中所述的裂解剂优选为Tris-SDS裂解液，其组成为IOOmmoI/L Tris-HCl,400mmol/L 氯化钠，I. 0%SDS，2%β -巯基乙醇，ρΗ=7. 5。 其中，为了提高楠木RNA纯度，以使更多的糖类析出，上述方法的d步骤中裂解后的溶液除去多糖等杂质的方法优选为加入高盐溶液和酸酚/氯仿溶液，混匀，离心，弃沉淀，所得上清液进入萃取步骤；所述的高盐溶液为I. O I. 4mol/L氯化钠和O. 6 I. Omol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比1:1的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至3. 7 ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为I. 6 2.4:2. 5 3. 5。进一步的，所述的高盐溶液最优选为I. 2mol/L氯化钠和O. 8mol/L柠檬酸钠的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液为酸酚和二氯甲烷按体积比I I的混合溶液，并用醋酸钠调节PH值至4. O ;高盐溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的体积比为2:3。本专利技术方法通过复合高盐(氯化钠和柠檬酸钠的搭配)更利于多糖类的析出。其中，上述e步骤中，优选采用二氯甲烷萃取楠木RNA。本专利技术方法采用二氯甲烷萃取楠木，其效果优于三氯甲烷，除杂效果更好。其中，本专利技术方法适用于楠木属的各种楠木RNA的提取,特别适合于桢楠PhoebezhennanS. Lee et FN WeiRNA 的提取。本专利技术方法通过乙二胺四乙酸盐溶液与乙酸乙酯混合对楠木材料预处理抽提多种次级代谢产物，减少RNA提取过程中的杂质干扰与污染，所提取的楠木RNA的纯度较高，所需试剂便宜，步骤简单，本专利技术为楠木RNA的提取提供了一种新的方法，具有广阔的应用前景。附图说明图I为不同RNA提取方法的琼脂糖电泳比较结果图。M :Marker(自上依次为2000、1000、750、500、250、100) ;A_B分别为Trizol和其改良试剂法；C :皂土法、D-E :CTAB法及其改良方法；F =Tris-SDS法；G :异硫氰酸胍法；H :试剂盒法；1 :本专利技术方法。具体实施例方式本专利技术提取楠木RNA的方法包括如下步骤a、按重量份取O. I份楠木叶片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的预处理液中，再加入O. I O. 3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；其中，所述的预处理液为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2 4wt%，乙二胺四乙酸的浓度为80 UOmmolL-1，β -巯基乙醇的浓度为I. 5 2. 5%ν/ν ；b、匀浆液静置I 3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；C、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。目前的RNA的提取方法一般都是直接进行裂解处理，没有前处理步骤，本专利技术方法通过乙酸乙酯+预处理液处理，可以除去大部分精油脂类、糖类、酚类和色素类杂质，有利于提高楠木RNA纯度。·进一步的，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液的温度优选为40 440C。a步骤中所述的预处理液的温度最优选为42°C。其中，为了提高除杂质效果，a步骤中所述的预处理液优选为可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为3wt%，乙二胺四乙酸的浓度为lOOmmolL—1，β-巯基乙醇的浓度为2%ν/ν。其中，上述方法的C、d、e步骤可以按照常规方法进行。进一步的，为了提高楠木RNA纯度，c步骤中所述的裂解剂优选为Tris-SDS裂解液，其组成为IOOmmoI/L Tris-HCl,400mmol/L 氯化钠，I. 0%SDS，2%β -巯基乙醇，ρΗ=7. 5。其中，为了提本文档来自技高网...

【技术保护点】
提取楠木RNA的方法，其特征在于包括如下步骤：a、按重量份取0.1份楠木叶片，磨成粉，然后加入到0.8～1.5份的预处理液中，再加入0.1～0.3份的乙酸乙酯，混匀，得到匀浆液；其中，所述的预处理液为：可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、β？巯基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2～4wt%，乙二胺四乙酸的浓度为80～120mmolL？1，β？巯基乙醇的浓度为1.5～2.5%v/v；b、匀浆液静置1～3分钟；离心，溶液分为三层，弃去上面两层，保留下层的沉淀；c、b步骤所得沉淀加入裂解剂裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等杂质；e、萃取、离心，所得上清液用异丙醇沉淀，所得沉淀用70～80wt%的乙醇溶液洗涤，得到楠木RNA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庄国庆，龙汉利，李晓清，
申请(专利权)人：四川省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：