本发明专利技术公开了PRAME、WT1双价肿瘤DNA疫苗，该疫苗的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本发明专利技术DNA疫苗构思巧妙，在人体内的表达率高，适用人群广。通过增强机体针对PRAME和WT1抗原蛋白的特异性体液和细胞免疫反应，对PRAME和WT1抗原阳性肿瘤进行杀伤，从而达到治疗多种癌症目的。由于PRAME和WT1在多种癌症的肿瘤细胞中有特异性高量表达，而在人体正常细胞中不表达，所以该DNA肿瘤疫苗将能够用于治疗多种癌症。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及PRAME、WTl双价肿瘤DNA疫苗。
技术介绍
手术、放疗和化疗是癌症治疗的三种常规手段，近年来，随着新型化疗药物的研发上市，手术与放疗技术的不断更新，肿瘤患者的长期存活率有所提高。然而，由于肿瘤的早期诊断技术还不尽完善，相当一部分实体瘤患者在手术时已有不同程度的转移。放疗和化疗虽然能在一定程度上预防扩散和转移，但仍有相当一部分患者不能免于复发。其次，现代科学证明肿瘤干细胞及循环肿瘤细胞是导致转移与复发的根源，而三大常规疗法对这两类肿瘤细胞作用很小。 肿瘤免疫学(tumor Immunology)是利用免疫学的理论和方法,研究肿瘤的抗原性、机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系,机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫的机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学。肿瘤免疫学在过去的十多年有突飞猛进的进展。首先，现在已证明肿瘤患者存在对肿瘤的特异性免疫反应，手术、化疗、放疗所治愈的部分肿瘤患者，并不是因为这些手段能杀死全部肿瘤细胞，而是由于当肿瘤细胞负荷显著降低时，机体的免疫功能有所恢复，清除了微小残留病灶或抑制残留肿瘤细胞的增殖。其次，过继免疫疗法的临床实验证明，当患者被注入足够量的肿瘤特异的效应细胞(LAK或TIL)时，不但能延长总存活期，在部分患者中并能观察到肿块缩小。结合这两方面的结果，治疗性肿瘤疫苗受到越来越多的关注。此类疫苗的作用机理是运用增强肿瘤特异性抗原的免疫原性的方法，诱发机体的抗肿瘤免疫应答，达到缩小和消除肿瘤的目的。目前在临床试验上用的肿瘤疫苗有多种形式，有细胞型(树突状细胞，灭活的肿瘤细胞)、细胞均浆型、合成生物大分子型(多肽、蛋白、DNA/RNA)，及病毒载体型。其中，DNA疫苗具有多方面的优越性。第一，它能诱导产生具有长期免疫记忆的免疫应答。第二，裸露DNA不含诱导产生抗体反应的抗原组份，而这些抗疫苗的抗体会削弱疫苗的效价。第三，生产与制备成本低，工艺简单。尽管DNA疫苗的优势明显，由于其在人体内的表达效率低等原因，以致临床效果不甚理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供PRAME、WTl双价肿瘤DNA疫苗。该DNA疫苗构思巧妙，在人体内的表达率高，适用人群广。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是PRAME, WTl双价肿瘤DNA疫苗，该疫苗的核酸序列如SEQ ID NO 1所示。所述核酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述PRAME、WT1双价肿瘤DNA疫苗在制备用于肿瘤治疗药物或疫苗中的用途。所述肿瘤为WTl阳性肿瘤和/或PRAME阳性肿瘤。所述肿瘤包括胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、肠癌、子宫内膜癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、神经内分泌癌、肝癌、胆囊癌、骨癌、软组织癌、食道癌、淋巴瘤等。上述PRAME、WTl肿瘤DNA疫苗可以通过下述主要步骤的方法得到按照SEQ ID NO :1所示的核酸序列进行抗原基因合成，此序列包括多段PRAME和WTl基因片段，片段连接序列，HindIII, EcoR I限制性内切酶识别序列和KozaK翻译起始序列。之后通过HindIII和EcoR I限制性内切酶将抗原基因和pVAXl质粒分别进行剪切，使其暴露粘性末端。再用DNA连接酶将抗原基因和pVAXl质粒通过粘性末端相连，成为重组质粒。将重组质粒转染大肠杆菌，使其在大肠杆菌细胞中复制、扩增。经质粒的抽提和纯化，得到满足要求的PRAME、WTl双价肿瘤DNA疫苗。 本专利技术选用多段PRAME和WT-I基因片段序列，并将这些片段以串珠方式连接，加上限制性内切酶和Kozak翻译起始序列进行全基因合成，并连接到商品用载体P VAX I (Invitrogen)以完成疫苗构建。编码区同时连接至大肠杆菌表达质粒,用于少量制备蛋白多肽来作为评价疫苗效价的试剂。本专利技术为了达到比较好的治疗效果，防止肿瘤因抗原流失而躲避免疫攻击，专利技术人经过多次反复试验设计了一个双价疫苗包括两种不同的肿瘤抗原，PRAME (Melanomaantigen preferentially expressed in tumors)和 WT_l(Wilms tumor protein)。这两种抗原在癌细胞的增殖、转移及扩散中起不同的作用。PRAME参与视黄酸受体相关的信号转导，被认为对肿瘤细胞的生长与抗凋亡的功能有关。而WT-I则被认为是一个转录因子，参与肿瘤细胞的多种生物功能。这两种抗原在胰腺癌标本中的表达率都比较高(> 75% )，除之以外，它们在其他实体瘤与血液癌中的表达率也相当高。本专利技术将肿瘤相关抗原PRAME和WTl部分片段基因序列及其他相关序列重组，并构建到真核表达DNA质粒载体中，以该质粒为主要成分制成注射剂药物，用于治疗多种恶性肿瘤。其原理为该疫苗在被注射进入人体后，可进入人体细胞并表达重组抗原蛋白，进而激发人体针对PRAME和WTl抗原的特异性免疫反应。所产生的特异性体液和细胞免疫将杀灭PRAME和WTl抗原阳性肿瘤，达到癌症治疗目的。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是本专利技术肿瘤DNA疫苗构思巧妙，在人体内的表达率高，适用人群广。通过增强机体针对PRAME和WTl抗原蛋白的特异性体液和细胞免疫反应，对PRAME和WTl抗原阳性肿瘤进行杀伤，从而达到治疗多种癌症目的。由于PRAME和WTl在多种癌症的肿瘤细胞中有特异性高量表达，而在人体正常细胞中不表达，所以该DNA肿瘤疫苗将能够用于治疗多种癌症。附图说明本专利技术将通过例子并参照附图的方式说明，其中图I是本专利技术实施例I转基因动物体液免疫效价评价结果图；图2是本专利技术实施例I转基因动物细胞免疫效价评价结果图；图3是本专利技术实施例I转基因动物免疫细胞体外杀伤肿瘤细胞的效价评价结果图；图4是本专利技术实施例I转基因动物体内肿瘤细胞杀伤实验评价结果图5是本专利技术实施例2人外周血体外细胞免疫效价评价结果图；图6是本专利技术实施例2人外周血免疫细胞体外杀伤肿瘤细胞的效价评价结果图。具体实施例方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。实施例I :免疫转基因小鼠检测特异免疫反应强度和抗肿瘤细胞效果实验 实验方案如下I、受试动物10-12周龄HLA-A2. I转基因雌性小鼠。2、受试动物分组HLA-A2. I转基因小鼠随机分为两个大组，每个大组分为三个小组，每小组分别标为I) 1-1 :动物体外实验实验组2) 1-2 :动物体外实验对照组3) 1-3 :动物体外实验观察组4)2-1 :动物体内实验实验组5)2-2 :动物体内实验对照组6)2-3 :动物体内实验观察组每小组各15只转基因小鼠，共90只。3、淋巴结免疫注射(观察组不注射)方法I)稀释质粒分别取2mg重组质粒和空质粒(pVAXl)，用IX PBS缓冲液稀释到0.4mg/ml,以备后续实验使用。2)麻醉动物使用异氟烷气管吸入麻醉。3)进行淋巴结免疫注射前，分别在1-1和1-2组小鼠眼眶静脉丛取血本文档来自技高网...
【技术保护点】
PRAME、WT1双价肿瘤DNA疫苗，其特征在于该疫苗的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.PRAME、WT1双价肿瘤DNA疫苗，其特征在于该疫苗的核酸序列如SEQ ID NO :1所示。2.根据权利要求I所述的PRAME、WTl双价肿瘤DNA疫苗，其特征在于所述核酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3.权利要求I所述的PRAME、WTl双价肿瘤DNA疫苗在制备用于肿...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱义，
申请(专利权)人：四川百利药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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