本发明专利技术涉及具有高区域选择性酰化活性的细胞催化剂的制备方法及合成阿糖胞苷单酯的微生物方法，制备方法是将初始菌株荧光假单胞菌PseudomonasfluorescensGIM1.209种子液接种至含20～40g/L产酶诱导剂的液体培养基中，20～40℃摇瓶培养24～72h后离心收获瓶内菌体，蒸馏水或缓冲液洗涤两次后真空冷冻干燥12h以上制成全细胞催化剂。所制备的细胞催化剂具有高区域选择性酰化反应活性，区域选择性高于93%，能够适用于胞苷单酯的制备，具有比酶催化剂成本低，效率高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化剂领域，涉及一种具有高区域选择性酰化反应的细胞催化剂的方法。
技术介绍
目前阿糖胞苷酯类衍生物的合成采用化学合成法或者离体酶法。为克服化学制备方法环境不友好、选择性差、副产物多等缺点，自上个世纪末人们开始研究利用酶法进行核苷单酯的合成。然而，尽管酶法合成具有区域选择性高、反应条件温和、环境友好等优点，其在工业应用上却遭遇成本高、催化剂稳定性差等诸多瓶颈问题。全细胞是生物催化剂的一种，作为酶的天然载体，可以省去酶分离纯化及固定化等步骤，从而大大地降低生产成本。此外，整细胞可为酶提供良好的环境，使酶不至于在非水介质中快速失活。然而，迄今为止， 利用高区域选择性微生物细胞催化阿糖胞苷单酯的合成的研究尚未见报道。微生物全细胞一步法制备阿糖胞苷单酯，是绿色的生物反应途径，为阿糖胞苷单酯的工业化生产提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术针对现有用于核苷类似物酯合成的催化剂的不足，目的在于提供。所述的微生物全细胞催化剂制备方法简单易操作，原材料价廉易购买，不涉及酶的分离纯化。本专利技术合成的微生物全细胞催化剂区域选择性达到96%以上且催化转化率在70%以上，克服了传统化学方法的选择性低、易生成副产物等缺点。与酶制剂相比，微生物细胞催化剂具有价廉、易获取、在非水介质中稳定性高的优点。本专利技术通过如下技术方案实现。一种具有高区域选择性酰化活性的细胞催化剂制备方法，该方法是将初始菌株突光假单胞菌fluorescens GIM1. 209种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为1°/Tl2%，2(T40°C摇瓶培养24 72 h，离心收获湿菌体，经蒸馏水或缓冲液洗涤两次后，真空冷冻干燥12-18 h制成微生物全细胞催化剂。所制得的微生物全细胞催化剂区域选择性在96%以上且催化转化率在70%以上，具有高区域选择酰化活性。进一步优化的,所述产酶诱导剂包括Tween 80> Tween 85> Span 60> Span 80中的一种或两种。进一步优化的，以液体培养基总体积为基准，所述液体培养基的成分为2(T40g/L 产酶诱导剂，O. 5 50 g/L 酵母膏，O. 2 4 g/L MgSO4·7Η20, 2 15 g/L (NH4)2SO4,1 g/LK2HPO4,液体培养基pH为6. 8-7. 5。进一步优化的，所述缓冲液为pH 5. 5^7. 5的柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液。本专利技术的合成阿糖胞苷单酯的微生物方法，具体是以阿糖胞苷和羧酸酯为底物，以权利要求I所制得的微生物全细胞为催化剂，以吡啶-己烷、吡啶-异丙醚为反应介质发生酯合成反应，得到阿糖胞苷单酯产物。进一步优化的，底物中阿糖胞苷含量为1(T50 mmol/L，羧酸酯与阿糖胞苷的摩尔比为15:1飞0:1，全细胞催化剂的用量为2(Tl00 g/L反应体系，合成反应温度为2(Γ60 V,反应过程振荡速度60 rpnT240 rpm，反应时间在12-72 h，可得到阿糖胞苷单酯。本专利技术与现有的技术相比具有如下的优点 I.采用微生物全细胞催化剂来高效催化合成阿糖胞苷5'-单酯合成，具有较之以前技术更高的区域选择性，及产物结构易控、反应副产物少等优点，并克服了化学催化剂环境不友好，产物纯度低，易生成副产物等缺点。 2.微生物全细胞催化剂制备过程易操作、制备成本低。3. 一步法催化阿糖胞苷单酯合成，无须基团保护和去保护、反应过程简单易控、产物容易分离。·4、在所限定的工艺条件下所制得的微生物全细胞催化剂区域选择性在96%以上且催化转化率在70%以上，具有最佳的催化阿糖胞苷酰化反应效果。具体实施例方式 为更好理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术做进一步地详细说明，需要说明的是，这些实施例并不构成对本专利技术保护范围的限制。实施例I 将经培养的fluorescens GIM1. 209种子液转接至含Tween 80产酶诱导剂液体培养基中培养。液体培养基成分为20 g/L Tween 80，0.5 g/L酵母膏，O. 2 g/L MgS04*7H20，2 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 为 7· O。20°C摇瓶培养 24h 后离心收集湿菌体，PH5. 5柠檬酸盐缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥12 h后得全细胞催化剂。将所制备的细胞催化剂(用量为5 g/L)加入阿糖胞苷含量为25 mmol/L，羧酸酯与阿糖胞苷的摩尔比为15:1的己烷吡啶中，合成反应温度为60 °C，反应过程振荡速度60 rpm，反应时间在24 h，可得到阿糖胞苷单酯。该催化剂的催化阿糖胞苷酰化反应的区域选择性为96%，催化转化率为75%。实施例2 将经培养的fluorescens GIM1. 209种子液转接至含Tween 85产酶诱导剂液体培养基中培养。液体培养基成分为30 g/L Tween 85，40 g/L酵母膏，4 g/LMgSO4*7H20 ,15 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 为 7· 0。40°C摇瓶培养 72h 后离心收集湿菌体，pH5. 5柠檬酸盐缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥24 h后得全细胞催化剂。将所制备的细胞催化剂(用量为50 g/L)加入阿糖胞苷含量为50 mmol/L，羧酸酯与阿糖胞苷的摩尔比为18:1的己烷-吡啶中，合成反应温度为60 °C，反应过程振荡速度60 rpm，反应时间在24 h，可得到阿糖胞苷单酯。该催化剂的催化阿糖胞苷酰化反应的区域选择性为97%，催化转化率为74%。实施例3 将经培养的fluorescens GIM1. 209种子液转接至含Span 60产酶诱导剂液体培养基中培养。液体培养基成分为25 g/L Span 60，30 g/L酵母膏，2 g/LMgSO4*7H20 ,10g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 为 7. 0。30 °C摇瓶培养 48 h 后离心收集湿菌体，pH 5. 5磷酸盐缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥24 h后得全细胞催化剂。将所制备的细胞催化剂(用量为100 g/L)加入阿糖胞苷含量为2 mmol/L，羧酸酯与阿糖胞苷的摩尔比为50:1的己烷-异丙醚中，合成反应温度为20 °C，反应过程振荡速度100 rpm，反应时间在12h，可得到阿糖胞苷单酯。该催化剂的催化阿糖胞苷酰化反应的区域选择性为97%，催化转化率为74%。实施例4 将经培养的fluorescens GIM1. 209种子液转接至含Span 80产酶诱导剂液体培养基中培养。液体培养基成分为25 g/L Span 80，30 g/L酵母膏，2 g/LMgSO4*7H20 ,10g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 为 7. 0。30 °C摇瓶培养 48 h 后离心收集湿菌体，pH 5. 5磷酸盐缓冲液洗涤两次，真空冷冻干燥24 h后得全细胞催化剂。将所制备的细胞催化剂(用量为55 g/L)加入阿糖胞苷含量为20 mmol/L，羧酸酯与阿糖胞苷的摩尔比为35:1，合成反应温度为35 °C，反应过程振荡速度2 40 rpm，反应时间在36 h，可得到阿糖胞苷单酯。该催化剂的催化阿糖胞苷酰化反应的区域选择性为96%，催化转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有高区域选择性酰化活性的细胞催化剂制备方法，其特征在于：将初始菌株荧光假单胞菌Pseudomonas?fluorescens?GIM1.209种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，接种量为1%~12%，?20~40℃摇瓶培养24?~72?h，离心收获湿菌体，经蒸馏水或缓冲液洗涤两次后，真空冷冻干燥12?18?h制成微生物全细胞催化剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓凤，吴晖，赵光磊，余以刚，卢志洪，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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