本发明专利技术是利用生物技术研制出的一组抗人CD146分子及建立的高灵敏度夹心ELISA检测可溶性CD146的方法。本发明专利技术包括：抗人CD146鼠单克隆抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，利用抗体组合及夹心ELISA特异性检测可溶性CD146的方法。这组抗体能够在分子、细胞和组织水平特异性识别人源CD146，并基于其识别不同表位而分成两类。由抗体AA1与另一株抗人CD146鼠单抗AA98组合的夹心ELISA方法能够检测到每毫升钠克量级可溶性CD146。这些抗体及此种检测手段将成为基础研究或临床应用中有效的检测或诊断的工具及方法，同时也将为与CD146相关疾病的靶向治疗提供良好载体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物
具体地说本专利技术涉及一组抗人⑶146的鼠单克隆抗体，这组抗体能够在生化、细胞和组织水平特异性识别人源⑶146蛋白。本专利技术还涉及一种夹心ELISA检测可溶性CD146的方法，在这种检测方法中捕获抗体是本专利技术中涉及的鼠单克隆抗体，检测抗体是用生物素标记的专利技术专利ZL 991075862中涉及的鼠单克隆抗体AA98。
技术介绍
⑶146，又名MUC18，Mel-CAM/MCAM,是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子。CD146胞外有五个免疫球蛋白样结构域(V-V-C2-C2-C2) (HolnessandSimmons 1994)，并被高度糖基化，介导钙离子非依赖的细胞间相互黏附。⑶146最早发现是黑色素瘤的标志分子，参与黑色素瘤的转移及恶化(Lehmann，Riethmuller et al. 1989 ；Sers,Kirsch et al. 1993)。CD146 在黑色素肿瘤中的异常高表达增强了肿瘤细胞之间的黏附，并对于肿瘤的侵袭和转移非常重要(Johnson，Rothbacheret al. 1993)。研究表明，⑶146的表达与黑色素瘤细胞的转移能力直接相关，而在不表达CD146的黑色素瘤细胞中过量表达CD146可以显著增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力(Bani，Rak et al. 1996 ；Shih, Speicher et al. 1997 ；Xie, Luca et al. 1997)。此外，CD 146 也表达在少量的正常组织中，比如平滑肌，血管内皮和滋养层等(Shih 1999)。同时，⑶146也被广泛认为是血管内皮细胞的特异性标志分子(Bardin，Franceset al. 1996 ；Bardin, Anfosso et al. 2001)。在之前的研究中，抗人CD146抗体被应用检测血液中的循环内皮细胞(George, Poncelet et al. 1991 ；Bardin, George et al. 1996 ；Solovey, Gui et al. 2001)。由于这一特征,在伴有内皮损伤、脱落现象的某些疾病中，⑶146可作为疾病进程的参考指标。另有研究表明⑶146分子还表达于单核细胞，有报道在激活的T淋巴细胞上也有高表达(Pickl，Majdic et al. 1997)。像其它很多黏附分子一样，体内CD146分子以细胞膜和可溶形式(soluble CD146，sCD146)存在(Neidhart，Wehrliet al. 1999 ；Bardin, Moal et al. 2003)。研究表明sCD146在风湿性关节炎滑液以及慢性肾衰竭患者的血清中的表达水平明显高于正常人。抗人CD146抗体在动物实验中体现出了很强的抑制肿瘤生长的治疗效果。Mills等开发的抗CD146全人抗体，ABX-MAl在裸鼠模型中显著地抑制黑色素肿瘤的生长、侵袭以及向肺部的转移(Mills,Tellez et al. 2002)。专利技术专利ZL 991075862中所述，开发的抗CD146鼠单克隆抗体AA98具有抑制肿瘤血管生成的作用，并在多种裸鼠荷瘤实验中明显抑制肿瘤(例如肝癌、胰腺癌等)的生长(Yan，Lin et al. 2003)。进一步的研究还揭示了AA98的抑制肿瘤血管生成的机制是通过抑制MAPK磷酸化以及NF κ B活化实现的(Bu，Gaoet al. 2006)。虽然抗人源⑶146的抗体已有一些报道，但是这些抗体对不同的血管内皮组织却有着不同的结合活性。例如S-endol能够结合各种类型的血管的内皮细胞，包括动脉、细动脉、静脉、小静脉、毛细血管、高内皮微静脉和淋巴血管系统等(George，Poncelet etal. 1991)。而另一株抗CD146抗体MUC18只结合毛细血管和高内皮微静脉(Kuzu，Bicknellet al. 1993)。S-endol结合胳带静脉内皮组织而MUC18不结合(Bardin, Frances etal. 1996)。此外，P1H12能够同时结合肿瘤和正常组织的血管内皮细胞(St Croix7Rago etal. 2000)，而AA98却特异性的结合肿瘤组织的血管内皮细胞(Yan, Lin et al. 2003)。这些证据表明，很可能不同的抗体结合表位在不同的组织和微环境中的暴露情况有所差异。因此，针对CD146蛋白上不同表位开发抗体，并研究其对于不同组织的结合能力，对于阐明⑶146在血管内皮细胞上的功能非常必要。
技术实现思路
本专利技术利用天然纯化的CD146蛋白免疫小鼠，获得杂交瘤细胞。用ELISA的方法筛选与重组表达的⑶146蛋白胞外区有强结合能力的抗体，获得六株抗体，分别命名为AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，同时获得分泌这些抗体的杂交瘤细胞，依次是8E8、8F4、A5、GlO、H5①和H5②。这六株抗体均属IgGl，K亚型。ELISA和免疫印迹的实验证实了这些抗体和⑶146分子的特异性结合。利用重组表达的⑶146蛋白胞外不同的结构域以及免疫印迹的方法，证实AAl和AA2识别表位(序列为SEQ ID NO : I的人⑶146序列中的位置24-128)位于第一个IgV结构域，而AA3、AA4、AA5和AA7识别表位(序列为SEQ ID NO 1的人⑶146序列中的位置335-400)位于第二个IgC2结构域。因此，这六株抗体依照不同的抗原表位分成两类V1类(包括 AAl 和 AA2)和 C2-2 类(包括 AA3、AA4、AA5 和 AA7)。细胞免疫荧光，免疫沉淀及免疫组化实验发现Vl类抗体能够在分子、细胞及组织水平同时识别天然构象和变性的CD146蛋白质，而C2-2类抗体只识别变性的CD146蛋白质。这证实了不同的抗原表位在不同情况下的暴露有所不同。本专利技术同时利用Vl类抗体，如AAl和生物素标记的专利技术专利ZL991075862中涉及的鼠单克隆抗体AA98，开发了一套夹心ELISA的方法，用于检测溶液和体液中可溶性0)146分子。相比之前提供的商业化检测方法报道(CyQuant ELISA assay kit,Bioxytex,Marseille, France)的双抗夹心ELISA (灵敏度为10ng/ml),本专利技术的夹心ELISA方法灵敏度提高了一个数量级，达到lng/ml。此方法能够用于人血液及脑脊液中可溶性⑶146的检测，并在CD146表达异常的病症中具有临床诊断应用价值。运用本专利技术中的方法，发现在系统性血管炎等自身免疫病中，病人血清中的CD146分子含量显著升高，对于临床诊断具有指导意义和应用价值。具体地，本专利技术涉及一种人⑶146抗原表位，其氨基酸序列为SEQ IDNO 24或SEQID NO 25 所示。在一个实施方案中，本专利技术涉及一种抗人CD146抗体，其特征在于其能够特异性识别上述人⑶146抗原表位。优选地,所述抗人⑶146抗体特征在于包括抗体重链和抗体轻链，其中所述抗体重链包括作为⑶R的由SEQ ID NO 26的氨基酸序列组成的⑶R1，由SEQ ID NO 27的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO 28的氨基酸序列组成的CDR3组成，所述抗体轻本文档来自技高网...
【技术保护点】
SEQ？ID？NO：25所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：阎锡蕴，张莹，郑超固，杨东玲，冯静，卢迪，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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