本发明专利技术公开了一种以芸薹属植物基因表达的变化来检测镉污染的方法，从镉处理和对照的芥菜（Brassicajuncea）根中提取总RNA后与29K拟南芥芯片杂交，发现了镉诱导的特异表达的上调和下调基因，在这些基因的保守区设计引物，采用半定量PCR法，以表达量的增加或减弱2.00倍为标准，筛选并确定了当镉浓度大于1.00mg/kg时芥菜特异表达的6个上调基因和6个下调基因，利用这12个基因的引物检测环境中芸薹属植物的根中基因表达的变化，如6个上调基因引物扩增的待测环境中芸薹属植物的产物亮度比对照都增加2.00倍以上，且6个下调基因引物扩增的待测环境中芸薹属植物的产物亮度比对照都减弱2.00倍以上，则可以判定检测环境中镉的浓度大于1.00mg/kg，从而得知待检测环境中的芸薹属植物是否遭到镉污染。这种检测方法灵敏度高且特异性强，可以快速检测芸薹属植物所处的环境中镉的含量是否适用于农业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学方法检测环境污染的
，特别是涉及一种以芥菜镉特异诱导基因的表达变化来检测镉污染的方法。
技术介绍
传统的环境中镉检测通常采用原子吸收光谱仪检测，该法需要昂贵的仪器、良好的实验平台和较高的费用，不利于在基层环境检测单位和用户中推广，因此专利技术一种快速、简便、低廉的检测镉污染的检测方法很有必要。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,即PCR),是目前最流行的体外扩增DNA片段的技术，具有快速、敏感和特异性强等特点，如能将该技术用于镉相关基因表达的检测，将具有重要的意义和广阔的应用前景。·芥菜和白菜等在分类上都属于芸薹属，基因测序表明芸薹属各物种之间基因序列的保守性比较高。有研究表明芸薹属植物对镉有某种耐受或富集机制，镉处理可以特异诱导相关基因表达的变化。模式植物拟南芥与芸薹属的植物亲缘关系近，我们用拟南芥29K表达芯片与不同浓度镉处理的芸薹属植物芥菜的核酸杂交，发现了镉特异诱导的上调和下调表达的拟南芥同源基因，因此，在芥菜中克隆这些基因片段，并根据这些基因的保守区域设计引物，可以通过半定量PCR来检测这些镉诱导下特异表达基因的变化的情况来评价环境中的镉污染程度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服传统的镉污染检测方法的不足，提供一种快速、特异性好、灵敏度高的检测镉污染的方法。本专利技术方法使用试剂价格低廉，操作简单，效果明显，见效快，以便应用于农作物的安全栽培与生产。本专利技术采用的技术方案，其步骤包括 I确定镉诱导下特异表达的上调基因和下调基因 选取饱满、干净的芥菜种子，用75%乙醇浸泡I min，然后在O. 1%升汞中灭菌10-15min,无菌水冲洗2-3次,在无菌水中浸泡5_6小时后,用滤纸吸干多余的水分,接种于pH为6.O的1/2 MS固体培养基上，培养基含5g/L蔗糖，O. 7 %琼脂。镉(Cd2+)浓度水平分别为Omg/kg,O. 5mg/kg、l. Omg/kg 和 I. 5mg/kg，日夜长比为 14/10h，日夜温为 22/16°C，光照强度为200 μ mo I m_2 s — 1。在无菌条件下温室中生长15天,取固体培养基中的油菜根部进行实验。采集镉处理和对照组的芥菜，进行总RNA的提取，与拟南芥29K表达芯片杂交并进行信号分析，具体操作按常规的表达谱芯片使用说明进行。根据杂交信号的分析结果，找到芥菜镉诱导下特异表达的拟南芥同源的上调和下调基因，再利用同源克隆的方法在芥菜中克隆这些基因片段，以克隆这些基因片段序列为基础，在NCBI-BLAST中找到基因的保守区，在保守区利用软件Primer Premier 5. O设计引物，以Actin基因的表达为参照,其的正向引物 ACTF、ACTF 序列为5’ -GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3’，反向引物 ACTR 序列为5’ -CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3’ ；采用半定量PCR法，重复3次；PCR反应的总体积为10 μ L，PCR扩增的反应条件按常规的方法进行。进行PCR扩增温度如下先94°C 3min，再94°C，25s; 60°C , 25s; 72°C，30 s, 28个循环后，72°C延长6 min，反应结束后，得扩增产物。取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液(含溴酚蓝)，经2%的琼脂糖凝胶电泳15-30min后在紫外仪上观察，并利用图像软件分析扩增产物的亮度。根据国家土壤环境质量标准(GB15618-1995) 二级标准的临界值I. Omg/kg,以平均亮度增加或减弱2倍以上为标准，筛选并确定了芥菜镉浓度大于I. Omg/kg诱导下特异表达的6个上调基因和6个下调基因，以此作为镉污染检测的基因。所述芥菜镉诱导下特异表达的6个显著上调基因的引物(正向引物简称F，反向引物简称R)具序列如下UPl :F :5’- CGGAGTGGCTAAGCTTGTTCG-3’ R:5’-CCACAAGACCAAACATCAGCG-3’ UP2 F :5’-GCTGTCAAAGCTGGTGAAACC-3’ R:5’- CCGCAATCCTCAGCTAGAGC-3'UP3 F :5’-AAGAGCAAGCCAAGGAAGG-3， R :5’-GGCACTGTGGGCGAAGTAG-3' UP4 F: 5’-AATGGCGGATTTGAGGGAC-3’R: 5’-GCGGTGGTTGGTGTTTGTT-3’UP 5 F 5'-CTCTTTCAGACCGTTGTTC-3’R :5’-TCACTTTCTGCTCCTTTAT-3’UP 6 F 5' -GGTGGATGTGAACGGTAAG-3' R :5’-CCAACGCAGTTTGAATGTC-3' 所述芥菜镉诱导下特异表达的6个显著下调基因的引物(正向引物简称F，反向引物简称R)具序列如下DOWN I :F:5’-TTTTCTTCCGACAAATCAG-3’ R :5’-CAATATGTTCCCTTTCACC-3’DOWN 2 F: 5’-GCTTCTCAAGTACAACCCTA-3’ R: 5' -CTAAACATTTCAAACCCTCA-3'DOWN 3 F: 5’-GTAAGTGGGTTTGTGAGGT-3’ R: 5' -GAAATTGAGACAGGCTGAT-3'DOWN 4F: 5’-ACTTCGCTGACTCGGCTTGG-3’ R: 5' -CAGACGGCGGCGGTAAAA-3'DOWN 5 F: 5’-GGTATTAGGGTTTGGCTCG-3’ R: 5’-TGGTCATTCTCCGTCTCA-3’DOWN 6 F: 5’-CAGCCCTGAATCCTGACC-3’ R: 5' -GCCTTGACCAAAGCCACA-3' 2.检测环境中的镉污染，方法如下 (I)采集待检测环境及非污染对照区中的同种芸薹属植物的根，进行总RNA的提取和反转录。(2)以Actin基因的表达为参照，采用半定量PCR法，重复3次；PCR反应的总体积为10 μ L，PCR扩增的反应条件按常规的方法进行。进行PCR扩增温度如下先94°C 3min,再 94°C，25s; 60°C , 25s; 72°C , 30 s, 28 个循环后，72°C延长 6 min，反应结束后，得扩增产物。每个样品取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液(含溴酚蓝)，经2%的琼脂糖凝胶电泳15_30min后在紫外仪上观察，并利用图像软件分析扩增产物的亮度。(3)作出结论若用引物UP1、UP2、UP3、UP4、UP5和UP6扩增的待检测环境中芸薹属植物的亮度比对照都增加2倍以上，且引物D0WN1、D0WN2、D0WN3、D0WN4、D0WN5和D0WN6扩增的待检测环境中芸薹属植物的亮度比对照都减弱2倍以上则可以判定检测环境中镉污染的浓度大于I. Omg/kg。本专利技术有如下有益效果本专利技术依据以镉诱导下特异的差异表达的基因序列为基础，设计引物，建立了反转录——聚酶链式反应(RT-PCR体系)，在此基础上进行优化，建立了环境中镉污染的鉴定方法，可以用于鉴定某地区的土壤中的镉是否符合国家土壤环境质量标准，此方法快速、敏感和特异性强，与原本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以芸薹属植物基因表达的变化来检测镉污染的方法，其特征在于，步骤包括:步骤一：确定镉诱导下特异表达的上调基因和下调基因，方法如下:选取饱满、干净的芥菜种子，用75%乙醇浸泡1？min，然后在0.1%升汞中灭菌10？15？min，无菌水冲洗2？3次，在无菌水中浸泡5？6小时后，用滤纸吸干多余的水分，接种于1/2？MS固体培养基上，MS固体培养基的pH值为？6.0，其中含5g/L？蔗糖，0.7？%？琼脂，镉（Cd2+）浓度水平分别为0mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg和1.5mg/kg，日夜长比为14/10h,？日夜温为22/16℃,光照强度为200？μmol？m–2？s–1；在无菌条件下温室中生长15天，取固体培养基中的油菜根部进行实验；采集镉处理和对照组芥菜的根，进行总RNA的提取，与拟南芥29K表达芯片杂交并进行信号分析；根据杂交信号的分析结果，找到芥菜镉诱导下特异表达的拟南芥同源的上调和下调基因，再利用同源克隆的方法在芥菜中克隆这些基因片段，以克隆这些基因片段序列为基础，在NCBI？BLAST中找到基因的保守区，在保守区利用软件Primer？Premier？5.0设计引物，以Actin基因的表达为参照，采用半定量PCR法检测目的基因的表达，重复3次；PCR反应的总体积为10μL；进行PCR扩增温度如下：先94℃？3min，再94℃,？25s;？60℃,？25s;？72℃,？30？s,？28个循环后，72℃延长6？min，反应结束后，得扩增产物；取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液，经2%的琼脂糖凝胶电泳15？30min后在紫外仪上观察，并利用图像软件分析扩增产物的亮度；以平均亮度增加或减弱2倍以上为标准，筛选并确定了芥菜镉浓度大于1.00mg/kg诱导下特异表达的6个上调基因和6个下调基因，以此作为镉污染检测的基因；所述芥菜镉诱导下特异表达的6个显著上调基因的引物（正向引物简称F,？反向引物简称R）具序列如下：？UP1：F:5“？？CGGAGTGGCTAAGCTTGTTCG？3“？？？R:5“？CCACAAGACCAAACATCAGCG？3“？？？UP2：F:5“？GCTGTCAAAGCTGGTGAAACC？3“？？？R:5“？？CCGCAATCCTCAGCTAGAGC？3“？UP3：F:5“？AAGAGCAAGCCAAGGAAGG？3“？？？？？R:5“？GGCACTGTGGGCGAAGTAG？3“UP4：F:5“？AATGGCGGATTTGAGGGAC？3“？？？？？？R:？5“？GCGGTGGTTGGTGTTTGTT？3“UP？5：F:5“？CTCTTTCAGACCGTTGTTC？3“？？？？？？？R:5“？TCACTTTCTGCTCCTTTAT？3“UP？6：F:5“？GGTGGATGTGAACGGTAAG？3“？？？？？R:5“？CCAACGCAGTTTGAATGTC？3“所述芥菜镉诱导下特异表达的6个显著下调基因的引物（正向引物简称F,？反向引物简称R）具序列如下：？DOWN1：F:5“？TTTTCTTCCGACAAATCAG？3“？？？R:5“？CAATATGTTCCCTTTCACC？3“DOWN？2：F:5“？GCTTCTCAAGTACAACCCTA？3“？？？R:5“？CTAAACATTTCAAACCCTCA？3“DOWN？3：F:？5“？GTAAGTGGGTTTGTGAGGT？3“？？？R:5“？GAAATTGAGACAGGCTGAT？3“DOWN？4：F:5“？ACTTCGCTGACTCGGCTTGG？3“？？？R:5“？CAGACGGCGGCGGTAAAA？3“DOWN？5：F:5“？GGTATTAGGGTTTGGCTCG？3“？？？R:5“？TGGTCATTCTCCGTCTCA？3“？？？DOWN？6：F:？5“？CAGCCCTGAATCCTGACC？3“？？？R:5“？GCCTTGACCAAAGCCACA？3“？？步骤二：检测环境中的镉污染，方法如下:？1)采集待检测环境及非污染对照区中的在分类学上属于同种的芸薹属植物的根，进行根的总RNA的提取和反转录；2）以Actin基因的表达为参照，采用半定量PCR法，重复3次；PCR反应的总体积为10μL；进行PCR扩增温度如下：先94℃？3min，再94℃,？25s;？60℃,？25s;？72℃,？30？s,？28个循环后，72℃延长6？min，反应结束后，得扩增产物；每个样品取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液，经2%的琼脂糖凝胶电泳1...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严明理，冯涛，向言词，刘丽莉，柴立元，李夕兵，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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