本发明专利技术提供了针对植物中抗bar/PAT基因表达蛋白的单克隆抗体。所说的分泌单抗的细胞株4C2,其保藏编号为CGMCCNo.6341。本发明专利技术获得了抗体效价高、特异性强的杂交瘤细胞株，用该细胞株分泌的单克隆抗体在制备成检测植物中bar/PAT转基因成分的免疫胶体金试纸或Elisa试剂盒,可同时玉米、大豆、水稻、棉花及以其为原料的衍生产品,对转基因筛选和转基因安全评价，具有较为广泛的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，是一种单克隆抗体的制备和应用，涉及抗除草剂标记的转基因植物的检测技术。
技术介绍
如基因，为抗除草剂基因，编码蛋白一膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。该基因广泛应用于基因工程育种中，也是遗传转化中的标记基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin(PPT)为活性成分的除草剂。2001年全球种植的转基因作物面积达5260万hm2，抗除草剂作物占全球转基因作物的85%。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。由于抗除草剂标记在商业化转基因植物应用广泛，随着转基因食品的快速发展，国外转hr或基因的作物和食品的大量进入我国，转hr基因的食品检测技术是转基因食品安全性评价的重要技术平台，其研究具有重要的意义。·开展转基因外源蛋白的检测，主要的方法有即Western杂交、酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)等,这些方法都依赖特异性高、纯度高、效价高的蛋白抗体。本专利技术针对bar/pat基因表达蛋白检测设计的抗PAT蛋白单克隆抗体，该单抗具有高特异性、与其他转基因材料或表达蛋白无交叉反应，效价高，达到IO7以上。而单抗本身具有成本低，比多抗更敏感、精确、稳定，便于人为处理和质量控制，并可大量生产等优点，该单抗可用于快速检测植物、食品等农产品的转基因成分，及对公共卫生应急事件的检测，为抗除草剂转基因产品的检测提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种bar I pat蛋白单克隆抗体及分泌改单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术保护一种分泌如蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4C2,已于2012年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC No. 6341 本专利技术还保护所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。所述单克隆抗体在辅助鉴定转bar基因植物及其产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述单克隆抗体在辅助转基因植株培育中(玉米、大豆、水稻、棉花等)的筛选鉴定的应用也属于本专利技术的保护范围。所述植物体可为转基因初世代材料。本专利技术还保护所述单克隆抗体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒功能为如下Ca)辅助鉴定抗除草剂转基因植物； (b)辅助鉴定待测转基因植株是否为抗甘膦草除草剂植株； (C)辅助鉴定食品、饲料或其他加工产品原料中是否含有转bar/pat基因的转基因植物成分。本专利技术还保护含有所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒功能如下(a)辅助鉴定抗除草剂转基因植物； (b)辅助鉴定待测转基因植株是否为抗甘膦草除草剂植株； (C)辅助鉴定食品、饲料或其他加工产品原料中是否含有转bar/pat基因的转基因植物成分。所述植物具体可为水稻、大豆、玉米、烟草、苜蓿、棉花等。所述待测外源蛋白为bar或pat基因的表达蛋白。本专利技术提供的单克隆抗体用于植物中外源PAT蛋白检测，具有特异性好，效价高、广谱性等优点。本专利技术研制的抗PAT蛋白单克隆抗体，可用于研制转基因bar/pat的免疫学诊断试剂，如酶联免疫诊断试剂，胶体金免疫试纸条，抗体芯片等。 本专利技术的积极效果在于可用于快速检测植物、食品等农产品的转基因成分，及对公共卫生应急事件的检测，为抗除草剂转基因产品的检测提供技术支撑。本专利技术通过小鼠腹腔注射单抗细胞株，即可获得大量的单克隆抗体，可直接用于转基因植株的抗除草剂标记筛选，对今后转基因植物研发过程的阳性筛选和转基因食品安全评价具有很大的开发潜力。附图说明图I SDS电泳分析PAT蛋白表达M为蛋白质分子量标准I为300nm洗脱峰2为200nm洗脱峰3为IOOnm洗脱峰4为IOnm洗脱峰,5为穿透峰。图2纯化单抗的SDS-PAGE电泳图1，2为该细胞株表达的抗体蛋白，3为阴性细胞株;M为蛋白质分子量标准。图3利用该单抗进行转bar基因棉花Western blot检测 I为阴性细胞株对照；2为转bar基因棉花总蛋白；3为非转基因棉花总蛋白4为转EPSPS基因玉米种子总蛋白。图4该单抗在Elisa检测特异性的结果。图5该单克隆抗体在检测不同转Bar成分含量的检测灵敏度结果。图6试纸条检测转基因植物中PAT蛋白I为阴性水稻2为转bar基因水稻。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。实施例中所用的植物材料样品均来自农业部转基因成分检测中心(长春)标准阳性样品库。配制方法参考农业部178号公告-8-2012《转基因植物及其产品成分检测基体标准物质制备技术规范》每I升包被缓冲液按照如下方法配制将碳酸钠I. 59g、碳酸氢钠2. 93g和叠氮化钠O. 2g溶于去离子水，定容至IL ;包被缓冲液的PH值为9. 6。每I升洗涤缓冲液按照如下方法配制将氯化钠8. 0g、磷酸二氢钾O. 2g、磷酸氢二钠I. 15g、氯化钾O. 2g、吐温200. 5ml和叠氮化钠O. 2g溶于去离子水中，定容至IL;洗涤缓冲液的PH值为7.4。每I升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法配制将氯化钠8. 0g、磷酸二氢钾O. 2g、磷酸氢二钠I. 15g、氯化钾O. 2g和叠氮化钠O. 2g溶于去离子水中，定容至IL;缓冲液的PH值为7.4。HEPES buffer 蛋白抽提缓冲液IOOmM HEPES，pH 7. 5 ；5mM EDTA, 5mM HEPESbuffer EGTA ；10mM Na3V04 ；10mM NaF ；5% Glycerol ；2% 2-ME。封闭液溶于磷酸盐缓冲液中的1%BSA。底物缓冲液(磷酸盐-柠檬酸缓冲液)NaHP04 18. 42g，柠檬酸5. 10g, ddH20定容至 1L, PH 5. O。TMB 储存液IgTMB 溶于 100ml DMF。底物显色工作液ELISA底物缓冲液IOOml + 100 μ I TMB储存液+5 μ I预冷去离子水(用之前加)。 一、抗原的表达和制备 I.原核表达的bar基因片段合成 根据Genebank公布的Bar基因序列，并使用“clustal”软件对Bar基因核苷酸序列(552bp)，进行核苷酸和氨基酸序列(183aa)比对。在氨基酸序列不变的情况下，利用http://www. jcat. de/提供的信息进行密码子优化,获得更适合在大肠杆菌中表达的基因序列，核酸序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。表达载体的构建将上述优化核酸序列通过全基因合成，获得的567bp的bar基因片段克隆至pET-28a载体，构建重组质粒pET-Bar。质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，筛选阳性克隆。挑取含pET-Bar质粒的单克隆菌落，接种于IOOml含有氨苄青霉素的LB培养基(用LB (Amp+)表示)中，37°C震荡培养过夜。次日用LB(Amp+)稀释至1000ml，37°C培养至0D_ = I左右，加IPTG至终浓度为ImM。37°C继续培养6小时。4°C，5，OOOrpm离心10分钟，收集沉淀并用PBS洗涤。3.原本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌抗bar/PAT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC？No.6341。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龙丽坤，李飞武，张明，宋新元，王月华，刘巍巍，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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