本发明专利技术公开了抗人CD133单克隆抗体及其制备和应用，具体涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌，所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人CD133分子单克隆抗体杂交瘤细胞株14D7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2012年5月9日，保藏号为CGMCCNo.6095。本发明专利技术所述抗人CD133单克隆抗体14D7可作为生物学检测指标应用在肿瘤细胞检测中；并且，通过体外实验发现，本发明专利技术所述抗人CD133单克隆抗体对肿瘤细胞具有增殖抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单克隆抗体，具体涉及抗人CD133单克隆抗体及其制备方法，以及所述单克隆抗体在人单核细胞白血病细胞系SHI-I的体外增殖中的应用。
技术介绍
已知有许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、非MHC限制性的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为，第一信号决定了 T细胞活化的特 异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行(Noelle RJ, et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 89:6550，1992; Allen RC et al. , Science. 259:990,1993)。近年来，分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。根据其结构，这些共刺激分子可分为两类一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，包括 CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4_1BBL 和 Fas/FasL 等。另一类是免疫球蛋白超家族，如 B7-CD28/CTLA4、LAFl-ICAM-l/ICAM-2/ICAM-3、IC0S-GL50、CD2/LFA-3 等(Korthauer U et al. , Nature, 361:539，1993)。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。人⑶133 (prominin-Ι)是一种局限性分布于胞衆膜的突出处,如上皮微绒毛、附睾导管上皮的硬纤毛处的糖蛋白，因此根据拉丁文prominere,取名为prominin. 1997年，Yin等首次报道了一个新的造血干/祖细胞(HSPC)表面抗原AC133并制备了该抗原的单克隆抗体，2000年6月由国际白细胞分化抗原工作组会议(ILDAW)命名为⑶133。⑶133分子在蛋白结构上不同于4次跨膜(4-TM)和7次跨膜(7-TM)受体家族成员，它是5次跨膜(5-TM)受体家族中的第一个成员，分子量约为120kDa，其分子转录由5个不同的启动子控制。CD133分子具有胞外的氨基末端和胞内的羧基末端，以及胞外的8个一样的N-糖基化位点。CD133的分子结构和蛋白表达的特点提示它可能是作为生长因子受体发挥生物学作用。此外，有12个不同氨基酸序列的prominin-Ι剪接体相继在啮齿类和灵长类被发现。⑶133分子在干/祖细胞表达并随细胞分化快速下调，该特点使之成为内皮、脑、骨髓、肝脏、肾脏、前列腺、胰腺和包皮等组织检测和分离干/祖细胞的标记分子。此外，除了在正常组织表达外，在白血病细胞、脑胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中也能检测到CD133分子的表达。已有的研究结果表明CD133+肿瘤细胞具有很强的自我更新、增殖能力强和多向分化的潜能，提示CD133是研究肿瘤干细胞的重要靶分子之一。同时还有研究显示CD133分子可能在肿瘤免疫逃逸、药物耐受以及放疗抵抗中发挥了重要作用。人⑶133有2种亚型，继Yin克隆并鉴定了⑶133-1后Yu等克隆出⑶133-2，并发现与⑶133-1仅在胎脑和骨骼肌中呈优势表达特性不同，⑶133-2在许多胎儿组织和成熟组织中呈优势性表达，并在一些肺癌、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌细胞株中也有表达。两种异构体的表达谱不同，它们的功能是否有差异目前尚不清楚。虽然，自CD133分子发现后的10多年来一直为广大科研工作者所关注，但研究CD133分子的手段尚缺乏，特别是与其相互作用的分子尚未克隆，CD133的生物学功能及参与的信号通路至今尚不清楚。目前使用的商品化抗⑶133抗体(293C3，AC133, AC141,Miltenyi Biotec)在运用中存在一定的局限性(主要针对该分子的糖基化位点，故糖基化水平的变化影响直接影响了 CD133检测到的表达水平)。因此，研制抗人CD133功能性单克隆抗体将有助于揭示CD133的生物学功能，研究该分子在肿瘤发生、发展中作用机制，也为肿瘤干细胞的研究提供了一种新的手段。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种抗人⑶133单克隆抗体以及能产生所述抗人⑶133单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤 1)构建高表达人⑶133的转基因细胞将⑶133基因克隆入真核表达载体，转染小鼠成纤维细胞L929细胞，获得转基因细胞L929/CD133 ;用转基因细胞L929/CD133免疫BALB/C小鼠； 2)获取融合细胞生长克隆从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆； 3)应用流式细胞术法筛选后，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为保藏在中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No. 6095的杂交瘤细胞株。上述杂交瘤细胞株的保藏信息为保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期是2012年5月9日，保藏号为CGMCC No. 6095，其描述为分泌小鼠抗人⑶133分子单克隆抗体杂交瘤细胞株14D7。上述技术方案中，步骤I)中高表达人⑶133分子的转基因细胞L929/⑶133具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于L929细胞是鼠源性的成纤维细胞，细胞表面其他分子具有相对较弱的抗原性，因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产生，使单克隆抗体的筛选更为方便。上述技术方案中，步骤I)中，制备L929/⑶133细胞的方法可以按照本领域技术人员熟知的 DNA 操作技术(例如参见 Sambrook et al. , Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour, 1989)进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养。上述技术方案中，制备抗人CD133单克隆抗体的方法可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein, Nature 265:495 -497,1975)。也可以按照美国专利5，585，089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗单克隆抗体。采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人CD133分子单克隆抗体杂交瘤细胞株14D7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2012年5月9日，保藏号为CGMCC？No.？6095。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，陈旭勤，居颂光，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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