本发明专利技术公开了杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2及其分别产生的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2。本发明专利技术提供的两种单克隆抗体属于相同的IgG2a亚类，但是识别不同的表位，能够同时与具有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的NGAL重组蛋白特异性结合。本发明专利技术的两种单克隆抗体可应用于人体液中NGAL浓度的检测，具有重要的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体领域，涉及到杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2，及其分别产生鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1与鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2，可用于检测人体液中NGAL的浓度。
技术介绍
1993年中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin, NGAL)在中性粒细胞中首次被发现。国内外研究表明，NGAL与炎症、胚胎发育、免疫应答、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程有关。在卵巢癌细胞系、结肠肿瘤和乳腺癌中的NGAL的表达明显增强。免疫组化证明在NGAL在胰腺癌中会从阴性增加到强阳性，肺癌组织中的NGAL呈强阳性，而支气管肺泡细胞癌和粘液细胞癌染色最强。研究表明，在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL会显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。进一步研究证实，NGAL是多种原因引起的肾损伤的一个保护因素并且由于分子量小，对蛋白酶有天然的抗性，NGAL在肾脏损伤后很快聚积，可作为急性肾衰的诊断标记物，是有效评价急性肾衰临床治疗效果及预后的良好指标。美国专利2004 / 0219603和2005 / 0272101描述了 NGAL作为检测早期肾小管细胞损伤的标记物用途。目前，NGAL抗体的制备的方法一般采用多抗制备方法，即利用NGAL免疫动物，纯化抗NGAL抗体,最后运用SDS-PAGE、Western blotting分别鉴定抗NGAL抗体的纯度与免疫反应性。用这种方法制备的NGAL抗体特异性和一致性存在局限，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用上推广。目前市场上已存在NGAL单克隆抗体，但是这些抗体主要用于实验室实验研究，尚不能很好地用于检测人细胞中NGAL的临床检测。因此，目前临床上迫切需要满足要求的NGAL单克隆抗体，以便进行肾损伤的临床快速诊断和预后判断，并指导临床治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供可产生鼠抗人NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的可产生鼠抗人NGAL单克隆抗体的为杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2。杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2于2012年5月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号分别为 CCTCC N0:C201249、CCTCC N0:C201250。本专利技术的另一个目的是提供了鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2，所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2都能够与具有SEQ ID NO. I所示氨基酸序列的NGAL重组蛋白特异性结合。所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2均属于IgG2a亚类。所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2具有不同的表位，能同时与NGAL重组蛋白特异性结合，所述NGAL重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. I所/Jn ο所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体的方法，所述的方法包括用SEQ ID NO. I所示的NGAL-Trx重组蛋白为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，选择能产生与重组NGAL蛋白反应而与杂蛋白不反应的抗体的杂交瘤细胞,从杂交瘤细胞上清液中或者从注射杂交瘤细胞的小鼠腹水中获得所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体。 所述的NGAL重组蛋白的制备方法为^fSEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的质粒载体转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化后得到NGAL重组蛋白。本专利技术专利的又一个目的是提供鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2可用于人体液中NGAL浓度检测中的应用。所述的体液包括尿液、血液、血清、血浆或其他纯化组分。本专利技术的有益效果主要表现在提供了可产生鼠抗人NGAL单克隆抗体的为杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2，以及鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2 ；鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2通过双抗夹心对人体液中NGAL浓度进行检测，具有重要的应用前景。附图说明图I为SDS-PAGE电泳检测目标NGAL蛋白结果,样I为包涵体蛋白，样2为纯化后的NGAL-Trx重组蛋白，M为蛋白marker ； 图2为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1的效价结果，▲为杂交瘤细胞株3B1抗体，■为稀释液； 图3为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2的效价结果，▲为杂交瘤细胞株4C2抗体， 为稀释液； 图4为鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2亚型鉴定结果； 图5为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1与NGAL特异性结合的结果，其中，对照组为人血清白蛋白HSA和BL21裂解物； 图6为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2与NGAL特异性结合的结果，其中，对照组为人血清白蛋白HSA和BL21裂解物； 图7为鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2通过双抗体夹心法测定NGAL重组蛋白的结果。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术范围。实施例I :NGAL重组蛋白的制备 I、NGAL原核表达载体的构建 合成表I中的引物序列，采用套叠(Gene SOEing)PCR技术将引物全部加入进行PCR扩±曾，然后以一次PCR产物为模板，以引物I和引物24为上下游引物，进行二次PCR扩增，得到NGAL目的片段(如SEQ ID No. 2基因序列所示)。将其连接到原核表达质粒pET32a中，通过CaCl2法转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取菌落接种于50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，370C 220r/min震荡培养过夜，用菌液做PCR鉴定，阳性克隆送测序验证。表I引物序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
保藏号为CCTCC？NO：C201249的杂交瘤细胞株3B1和保藏号为CCTCC？NO：C201250的杂交瘤细胞株4C2。
【技术特征摘要】
1.保藏号为CCTCCNO :C201249的杂交瘤细胞株3B1和保藏号为CCTCC NO C201250的杂交瘤细胞株4C2。2.鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2分别由杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2产生，其特征在于，鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2都能够与具有SEQ ID NO. I所示氨基酸序列的NGAL重组蛋白特异性结合。3.权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2均属于IgG2a亚型。4.根据权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2能同时与NGAL重组蛋白特异性结合，具有不同的表位。5.一种制备权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏恩本，陈玲，杨艳，沈小娟，孔婷婷，
申请(专利权)人：南京基蛋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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