一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体，属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗人Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体。该杂交瘤于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：C201197。本发明专利技术最终获得同时拮抗三种活性状态Ras蛋白的鼠单克隆抗体，该针对p21Ras蛋白靶点的单克隆抗体可用于该蛋白的临床检测，还可进一步构建细胞内抗体，通过拮抗过表达的Ras蛋白，抑制组织的恶性转化而起到积极的预防肿瘤发生作用，对相应过表达Ras蛋白的肿瘤则起到积极的靶向抗癌作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗人Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-Rl及单克隆抗体。
技术介绍
Ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat sarcoma。Ras基因家族包括三个主要成员，S卩H-Ras, K-Ras和N-Ras，分别定位于第12、11和I号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即p21Ras蛋白，三种p21Ras蛋白的氨基酸序列约有85%的同源性。p21Ras蛋白作为极其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。p21Ras蛋白定位于细胞膜的内侧面发挥其生物学功能。p21Ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合形成一种分子开关机制。p21Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的p21Ras-GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱；而其在GTP酶激活蛋白水解下变成与GDP结合的非活性状态。当Ras基因发生突变、p21Ras蛋白过表达或Ras上游生长因子受体活化时均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30%的人类肿瘤中存在Ras基因突变或Ras蛋白过表达，部分学者认为Ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要角色。目前国内尚未有国产化的Ras蛋白抗体，而国外的商品化抗体多是针对三种Ras蛋白的共同区域合成多肽为免疫原制备的，这样筛选出来抗体是针对多肽序列的，且国外抗体价格通常较贵，也限制了该蛋白在临床检测中的推广应用。另外，蛋白质发挥其生物学功能是要通过折叠形成一定空间构象的，那么针对多肽序列所产生的抗体就会发生由于 Ras蛋白在折叠过程中形成空间位阻，导致抗体与抗原决定簇的结合能力下降；抗体所拮抗的抗原决定簇在蛋白质折叠过程中折叠进蛋白内部不能暴露于蛋白质表面，从而不能与活性状态的Ras蛋白结合的情况。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-Rl及其抗体，该抗体能用于ELISA、Western、免疫组织化学检测Ras蛋白，同时可为后续的Ras细胞内抗体的制备奠定基础。本专利技术的一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-Rl，于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国武汉武汉大学)，保藏号CCTCCNO C201197o所述的广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体，其特征在于该抗体是将分泌广谱抗p21Ras蛋白的交瘤细胞株KGH-R1，IX IO6个注射入预先经灭菌液体石蜡处理过的Balb/c小鼠腹腔内，然后待腹水足够多而小鼠处于濒死前抽取腹水，并将腹水离心收集上清获得的。本专利技术中，用基因合成和RT-PCR方法得到Ras基因的⑶S区全长序列，通过构建重组质粒，原核表达重组Ras蛋白，Ras蛋白复性后作为免疫原免疫小鼠，并取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0进行细胞融合，通过三种Ras蛋白的ELISA鉴定得到的。该杂交瘤细胞分泌的抗p21Ras抗体类型为IgG2b、κ。本专利技术中所参考的人H-Ras、K-Ras、N-Ras基因序列在GeneBank的登记号分别为NM_005343、M54968 和 BC005219。本专利技术中K-Ras、N-Ras基因的全蛋白表达序列(⑶S)通过人工合成方式获得。H-Ras的CDS区全长序列是从肝癌细胞株7703 (来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)中由RT-PCR方法获得，扩增基因引物序列为，正义链5’ -GGATCCAGAGGAGCGATGACGGAATATA-3’，上游引入 BamH I 酶切位点，反义链5’-AAGCTT GGTGGCATTTGGGATGTTC-3’，下游 引入Hindm酶切位点，原核表达载体为PET-28a ( + )。所述杂交瘤细胞株KGH-Rl的制备方法是将原核表达的p21Ras_H、p21Ras_N、p2IRas-K三种Ras蛋白经亲和纯化、复性后，用p21Ras_H为免疫原免疫小鼠，取血清效价大于I: IO6的Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG_4000进行融合，经次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脱氧核苷培养液(HAT)选择性培养(含20%的胎牛血清和RPMI-1640培养基)，用分别包被有复性后的H-Ras、K-Ras、N-Ras蛋白的ELISA板进行ELISA筛选，经过多次有限稀释，筛选出稳定分泌高效价的同时拮抗人p21Ras-H、p21Ras-N、p21Ras-K的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为KGH-Rl。KGH-Rl单克隆抗体的制备方法是以IX IO6个/只的细胞数将杂交瘤细胞KGH-Rl注入BALB/c小鼠腹腔，饲养10-14天，每日观察小鼠状况，等小鼠腹部膨胀时抽取腹水，以分别包被有三种Ras蛋白的ELISA板进行抗体效价及特异性鉴定；染色体计数确认融合成功；免疫层析实验鉴定抗体亚型；进一步用纯化的三种Ras蛋白行SDS-PAGE，以上述杂交瘤细胞株KGH-Rl的培养液上清(含所分泌的抗体)为一抗进行Western blot鉴定；并以该上清为一抗对19株肿瘤细胞株，分别是人胃癌细胞株BGC-853、MKN28，人肝癌细胞株QGY-7703、SMMC-7721、H印G2，人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病细胞株 THP-I、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宫颈癌细胞株 HeLa，人喉鳞癌细胞株H印-2，人卵巢癌细胞株SK0V3，人结直肠癌细胞株HCTl 16，人膀胱癌细胞株T-24 (以上细胞株均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行免疫细胞化学检测；对人体各系统常见的癌肿及正常组织进行免疫组织化学检测。结果显示该单克隆抗体的敏感性及特异性均较高，可特异性识别天然构象的p21Ras-H、p21Ras-N、p21Ras_K,可用于临床诊断性实验。本专利技术利用大肠杆菌原核表达H-Ras、K-Ras, N-Ras基因CDS区(蛋白编码区)的全长序列，通过蛋白质复性后恢复Ras蛋白的活性空间构象，用复性后的p21Ras-H作为免疫原免疫小鼠，并分别用p21Ras-H、p21Ras_N、p21Ras_K蛋白进行ELISA筛选，由于三种p21Ras蛋白的氨基酸序列约有85%的同源性，最终获得同时拮抗三种活性状态Ras蛋白的广谱单克隆抗体，该针对p21Ras蛋白的单克隆抗体可用于Ras蛋白的临床检测,还可进一步构建细胞内抗体，通过拮抗过表达的Ras蛋白，抑制组织的恶性转化而起到积极的预防肿瘤发生作用，对过表达Ras蛋白的肿瘤则起到积极的靶向治疗作用。附图说明图I 为 PET_28a(+)图谱。图2为H-Ras- PET_28a(+)测序 部分序列。图3为K-Ras- PET_28a(+)测序部分序列。图4为N-Ras- PET_28a(+)测序部分序列。图5 为 p21Ras 的 Western blot 分析； M :低分子量蛋白标准(Marker), 泳道1-3 :分别为纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH？R1，于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC？NO：C201197。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨举伦，陈玥，甄时建，周云刚，赵稳兴，
申请(专利权)人：杨举伦，
类型：发明
国别省市：
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