特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗体制造技术

本发明专利技术提供特异性结合HBV表面抗原(HBsAg)的抗体，其可有效预防和治疗乙型肝炎。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科中的一员，它会引发急性和慢性肝炎。世界人口中大约3. 5亿人，尤其在韩国和中国5-8%的人口是慢性HBV患者，而且HBV是肝病和肝癌的主因。虽然抗HBV疫苗的发展使预防乙型肝炎成为可能，但仍有很多人由于HBV感染而患上慢性肝炎。HBV感染会引起肝炎、肝硬化和肝癌，而且在慢性肝炎患者中肝癌的发生率比正常人高300倍，WHO (世界卫生组织)透露大约80%的肝癌是通过HBV感染由慢性乙型肝炎引起的。目前可用的乙型肝炎治疗药物包括核苷酸类似物，如拉米夫定(Iamivudine)Ja德福韦酯(adefovir dipivoxil)以及其它核苷酸类似物，已知它们能够抑制HBV的DNA聚合酶。但是，施用该类药物三年后，在75%的患者中出现了抗性病毒，导致疗效降低，因此将它们与乙型肝炎抗体制剂联合应用以预防垂直传播和肝移植后的感染。目前应用的乙型肝炎抗体制剂是采用高技术纯化和病毒灭活的方法，以具有抗-HBV抗体的人血为来源制备的，但由于具有高抗-HBV抗体的昂贵人血浆可用性低以及灭活似乎可行的人血浆来源的病毒成本高，这种方法不能满足日益增长的需要。尽f'i;K0hler和Milstein (1975)建立了制备单克隆抗体(mAb)的方法,源于小鼠的单克隆抗体已主要用于诊断或一些治疗。然而，由于以治疗目的施用于人体时，可能产生人抗鼠抗体(HAMA)，该鼠抗体不能施用。为了解决HAMA的问题，已经开发出了嵌合的和人源化的抗体。嵌合抗体含有鼠mAb的可变区(Fv片段)，其构成了整个抗体分子的约30%。相比之下，人源化抗体含有鼠mAb的CDRs (互补决定区)，其构成了整个抗体的约10%。虽然这类嵌合的和人源化的抗体明显降低了 HAMA反应，但在治疗需要长期和持续施用的慢性病如慢性肝炎时，采用人抗体可能更好。本专利技术致力于开发新的改进抗体(improved antibodies),并发现这类抗体可通过结合HBV表面抗原而用于灭活HBV。专利技术概述因此，本专利技术的一个目的是提供一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的新抗体。本专利技术的另一个目的是提供分别编码所述抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA,以及包括其的表达载体。本专利技术的再一个目的是提供用所述表达载体转化的细胞系。本专利技术的又一个目的是提供用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，其包括所述抗体。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体，其包括a)具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的重链可变区；b)具有SEQ ID N0:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区；c)重链恒定区；以及d)轻链恒定区。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供编码具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的重链可变区或具有SEQ ID NO: 2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区的DNA,以及包括其的表达载体。根据本专利技术的再一个方面，本专利技术提供用所述表达载体转化的细胞系。根据本专利技术的又一个的方面，本专利技术提供用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，其包括所述抗体。附图说明结合附图从本专利技术下面的描述中，本专利技术的上述和其它目的及特性将更加明显，图中分别显示如下 图I :电泳(1%琼脂糖凝胶)分析的图像结果，显示PCR合成的分别编码本专利技术的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA;图2 :包括本专利技术抗体的重链可变区和轻链可变区的噬菌体展示载体PKS4H的图谱；图3 :说明利用淘选技术(the panning technique)从抗体库筛选抗体过程的简图；图4 :从抗体库筛选出的本专利技术抗体的单链可变片段(scFv)的氨基酸序列；图5 :表达本专利技术的人抗体的重链HB48-33-重-pRC13、HB48-35-重-pRC13或HB48-59-重-pRC13的表达载体的图谱；图6、7和8 :分别为表达本专利技术的人抗体的轻链HB48-33-轻-pKC12、HB48-35-轻-pKC12和HB48-59-轻-pKC12的表达载体的图谱；图9 :从转化子表达的重链和轻链的SDS-PAGE分析；图10 :人抗体(HB48-33、HB48-35和HB48-59)对HBV表面抗原的相对亲和力；图11 :通过插入HBV DNA序列而由pcDNA3. I制备的载体pHBVl. 3-MBRI的图谱，该载体用于制备急性乙型肝炎小鼠模型；图12 :显示本专利技术人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的中和能力的曲线图，HB48-33、HB48-35和HB48-59是利用急性乙型肝炎小鼠模型通过体内效力试验筛选出的。已证实注射图11的质粒24小时后表达了 HBV表面抗原(HBsAg)，经施用本专利技术抗体后表面抗原减少。表面抗原米用Genedia HBsAg ELISA 3. O (Green Cross MS,韩国)测定。专利技术详述以下将详述本专利技术。本专利技术提供一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体，其包括a)具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的重链可变区；b)具有SEQ ID NO: 2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区；c)重链恒定区；以及d)轻链恒定区。本专利技术的抗体的特征在于，通过特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原以灭活HBV，有效预防或治疗乙型肝炎。特异性结合HBV表面抗原的抗体可通过改良的曬菌体展示方法(a phage displaymethod) (Smith,科学(Science), 228, 1315-1317，1985 ;以及 Hoogenboom&Chames,今日免疫学(Immunol Today), 21, 371-378, 2000)而优选地筛选。在噬菌体展示方法中，编码丝状噬菌体(如M13、Fd或Fl)表面蛋白的基因(基因III)与编码目标抗体的基因融合，以生成具有以抗体-曬菌体形式暴露在表面的融合抗体(a fused antibody)的病毒颗粒。随后，通过生物淘选技术，利用该抗体的高特异性和亲和性以及该噬菌体的高感染性可从噬菌体库中筛选目标抗体(Burton&Barbas,免疫学前沿(Adv. Immunol.), 57, 191-280, 1994 ；Winter 等，免疫学年度评论(Annu. Rev. Immunol. )，12，433-455，1994 ;以及 Hoogenboom 等，免疫技术(Imunotechnology)，4，1-20，1998 ;Kim 等，HybridHybridomics, 21，385-392，2002)。噬菌体展示载体可以为 pKS4H(见韩国专利 No. 0635370)或 pCANTAB5E，优选 pKS4H。本专利技术人已经从噬菌体库中筛选出三种人抗体(HB48-33、HB48-35和HB48-59)，并检测了抗体的亲和力和对于HBV表面抗原的中和能力(图10和11)。另外，还分析了重链和轻链可变区的氨基酸序列，并分别证实所有重链可变区具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID N0:2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：金世镐，张基奂，洪广元，辛庸源，金敏洙，李海元，柳憬桓，徐东赫，金振晚，辛龙男，具善美，林正爱，李美祯，李妍京，徐美先，
申请(专利权)人：株式会社绿十字，
类型：
国别省市：