本发明专利技术公开了一种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体及其制备方法和用途，属于生物技术领域。本发明专利技术首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV?2免疫VHH抗体库，筛选与PCV特别是PCV?2型病毒抗原具有良好亲和力的高特异性单域重链抗体（VHH），本发明专利技术所述的抗体具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列或与SEQ?ID?NO.1所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。本发明专利技术的PCV?2单域重链抗体对于研究猪圆环病毒，特别是对于研究猪圆环病毒2型的感染机理和建立高度敏感和特异的抗原快速检测或诊断试剂具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种抗体及其制备方法和用途，特别涉及以ー种抗PCV2型的双峰驼单域重链抗体。此外，还涉及到该抗体的制备方法、功能鉴定和用途。本专利技术属于生物
技术介绍
猪圆环病毒病是近些年来流行的一种猪的病毒性传染病，病原为猪圆环病毒2型(PCV2XPCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症的主要病原，并且还与猪繁殖障碍、猪呼吸道病综合症、猪皮炎与肾炎综合症、猪增生性坏死性肺炎、先天性振颤等疾病发生有夫。猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，该病毒无囊膜，是单股负链环状DNA病毒。根据其致病性、抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCVl和PCV2两个血清型。PCV2为致病病原，目前没有PCVl致病的报道。PCV2编码有11个开放阅读框0RF，由开放阅读框0RF2编码的CAP蛋白为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，能诱导机体产生中和抗体，还具有型特异性的表位。血清学调查表明，猪圆环病毒在世界上流行的范围很广，主要以混合感染和隐性感染为流行特点，猪群中存在大量病毒携帯者，表现为血清抗体阳性的亚临床症状。我国自有圆环病毒感染的报道以来，很多地区都有发病的报道，流行不断加剧。PCV2感染会引起机体的免疫抑制，这就为其它病原的感染提供了便利。猪圆环病毒病已经成为威胁养猪业的又一大传染病。面对如此严峻的疫病形式，建立快速、敏感、特异的诊断方法进行及时的诊断显得尤为重要。重链抗体(HCAbs)是发现于骆驼和软骨鱼等体内的ー种天然缺失轻链，仅有重链的饥体(Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, . et al. Naturally occurringantibodies devoid of light chains [J] Nature, 1993，363:446-448.)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区单域结构域组成，称为单域重链抗体(variable domain oftheheavy chain of HCAbs, VHH)D由于天然缺失轻链，单域重链抗体靠仅有的3个互补决定区(CDRs)就具备了特异的抗原结合能力及高亲和力，而普通抗体则需要6个CDRs才具备与抗原结合的能力。VHH是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量仅15kD，是常规抗体的1/10，单克隆抗体的1/3，其晶体结构为直径2. 5nm，长4nm的圆柱体，有人也称其为纳米抗体(Nanobody)。VHH的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大，⑶R3区也更长，能够形成更多的新结构，因而能补偿抗原结合位点VL的缺乏。并且，VHH具有易表达、水溶性好、耐高温、耐极度pH值等独特性质。作为ー种小分子抗体，VHH抗体有其独特的应用潜力。可应用在制备肤类药物、制备体内显影剂、构建免疫融合物、构建多价及多功能抗体、制备亲和纯化材料、作为细胞内抗体药物以及用于基础研究当中。抗体做为检测试剂的核心部分，其特异性及亲和カ决定了測定结果的准确性和灵敏度。目前，已有大量关于利用高特异性、高亲和カ的单域重链抗体建立检测方法的又献报道。Deckers 等(Deckers, N. , D. Saerens, et al. Nanobodies a promisingtool for species-specific diagnosis of Taenia solium cysticercosis. [J]int Jparasitol, 2009, 39(5) :625-633.)采用单域重链抗体建立了检测猪带绦虫囊尾蝴的ELISA检测方法，具有良好的特异性。Perruchini 等(Perruchini, C. , F. Pecorari, et al. LlamaV(H)H antibody fragments against GFAP:better diffusion in fixed tissues thanclassical monoclonal antibody [J]. Acta Neuropathol, 2009，118 (5) :685-695.)将单域重链抗体用于免疫组化实验，结果证实单域重链抗体 用于免疫组化实验中，具有扩散的距离长、有利于较厚切片的免疫标记和測定等优点。利用双峰驼制备PCV2VHH免疫抗体库，筛选PCV2特异性的VHH抗体，研制病原快速诊断方法在国内外尚无报道。本专利技术首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV2VHH免疫抗体库，筛选具有良好型特异性和抗原亲和性的单域抗体，对于建立敏感和特异的PCV2抗体检测方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之ー是提供ー种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体；本专利技术的目的之ニ是提供编码所述双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列；本专利技术的目的之三提供所述的双峰驼单域重链抗体或其编码序列在制备检测或诊断PCV2病毒感染试剂中的应用。为了达到所述的目的，本专利技术采用了以下技术手段本专利技术使用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼并利用噬菌体展示技术建立了 PCV2VHH免疫抗体库，经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆进行测序，结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为I. 12X108的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NAL-PCV2，从中筛选出具有高特异性和抗原结合能力的单域重链抗体(VHH)。本专利技术的ー种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO. I所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。在本专利技术中，优选的，所述的与SEQ ID NO. I所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。进ー步的，本专利技术还提供了编码以上所述的双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列。在本专利技术中，优选的，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQID NO. 6所示的序列。再进ー步的，本专利技术还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。更进一歩的，本专利技术还提供了ー种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有以上所述的核苷酸序列的真核或原核细胞。在本专利技术中，优选的，所述的宿主细胞为含有以上所述的表达载体的真核或原核细胞。本专利技术对得到的编码所述双峰驼单域重链抗体的基因进行了原核表达和纯化，通过结合力、特异性鉴定以及识别表位鉴定试验，证实获得的3株抗体具有很好的PCV2结合活性，其中2株(clonel和clone4)具有PCV2型特异性,通过抗体叠加实验证实3株抗体识别CAP蛋白上的不同表位。获得的VHH抗体能够在pH值2. 0的情况下耐受胃蛋白酶消化 30min。 利用有型特异性的2株抗体(clonel和clone4),通过双抗体夹心ELISA方法,对已知的PCV2阴性和阳性血清进行检测，结果表明该方法能够区分出血清抗体的阴阳性，并且能够反映出血清中PCV2抗体的含量，具有高敏感性和特异性。结果表明这2株抗体能够有效结合PCV2CAP蛋白，可以应用于PCV2血清抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下（a）或（b）所示的氨基酸序列：（a）SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列；或（b）与SEQ？ID？NO.1所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或 (b)与SEQID NO. I所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。2.如权利要求I所述的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的与SEQID NO. I所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。3.编码权利要求I或2所述的双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。5.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘湘涛，杨顺利，尹双辉，尚佑军，孙世琪，田宏，靳野，吴锦艳，陈妍，张克山，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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