本发明专利技术公开了一种能识别T-2和HT-2毒素的特异性单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞T-2所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：C201189。本发明专利技术还公开了检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法与试剂盒及其在T-2和HT-2毒素检测中的应用。与现有技术相比，本发明专利技术制备的单克隆抗体识别灵敏度高，抗体特异性好，?IC50值分别为1.46μg/L和26.26μg/L，本发明专利技术建立的酶联免疫方法及试剂盒检测精密度高、准确性好，样品处理方法简单，利于快速筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测分析和免疫学
，具体涉及一种用于检测T-2和HT-2毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。
技术介绍
T-2毒素和HT-2毒素是A类单端孢霉烯族毒素，由早熟禾镰刀菌(F. poae)和拟分枝孢镰刀菌(F. sporotrichioides)在湿冷的生长环境和潮湿的储存条件下产生,广泛存在于自然界，污染玉米、小麦、燕麦、黑麦等谷物，以玉米污染最为常见。T-2毒素和HT-2毒素能抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，干扰生物体能量代谢，有致癌和致畸性，对人、畜危害极大，因此建立灵敏的粮食和饲料中的T-2和HT-2毒素检测方法十分重要。粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JACFA)规定的T-2和HT-2毒素的每日最大耐受摄入量(PMTDI)为60ngKg(JECFA，2001)，以色列规定谷物饲料中T-2毒素不得超过IOOii g/kg，欧洲国家规定T-2和HT-2在谷物中的最高残留限量(MRL)为20-300 y g/Kg (FA0, 2004)，我国规定猪配合饲料和禽配合饲料中T-2毒素的允许量为lmg/kg (GB21693/2008)。目前检测T-2和HT-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相、液相色谱法以及酶联免疫方法(ELISA)、试纸条等免疫学方法。薄层层析法检测的精度低(最低检出量为200ng)，气相、液相需要精密仪器和专业操作人员，不利于大面积推广与快速检测。ELISA方法具有灵敏、快速、特异性强、简便等优点，适合大量样本的筛检，近年来倍受关注。ELISA基于抗原抗体反应实现检测目的，抗体对毒素的特异性决定了方法的灵敏性、假阳性率、假阴性率，所以制备特异的单克隆抗体是此类方法的关键。现有用于制备T-2毒素抗体的完全抗原有两类，一类抗原合成方法是用连接臂丁二酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)、0-羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)和T-2毒素C-3位置的羟基反应，C-3的羟基生成羧基，羧基和蛋白质的氨基连接，合成 T-2-HS(HG、CMO)-BSA (GIgG)。Chu 等(1985)合成抗原 T_2HS_GIgG，得到两株细胞12C12和15H6，单克隆抗体可以检测T-2毒素和HT-2毒素，12C12和15H6针 对 T-2 毒素的 IC5tl 分别是 133iig/mL 和 152iig/mL。1988 年，日本学者 Satoshi (1988)等用戊二酸酐代替琥珀酸酐，羊免疫球蛋白做连接蛋白，即合成抗原T-2HG-GIgG，获得细胞株7D4，抗体针对T-2毒素的IC5tl是Ing/mL。我国T-2毒素的抗体研究较晚，90年代杨传和(1990)制备抗原T-2HS-GIgG，得到细胞株1D7，IC5tl是180ng/mL。另一类抗原是用于检测T-2毒素的代谢物，Chu等(1987)在T-2的R8侧链水解，生成T_2tetraol、T_2tetraol四乙酸盐，再酶解T-2tetra0l四乙酸盐生成T_2毒素的中间代谢物3_AcNE0S，最后合成完全抗原3-AcNEOS-HS-BSA，得到细胞株H159B1D5，所得抗体可识别T-2毒素及其代谢物(T-2、Ac-T-2、3-0H-T-2、DAS)，这种方法比较复杂，反应的步骤较多，特别是T_2tetraol的产率低于10%，副产物多，需要耗费大量T-2毒素，这些缺陷严重制约了这种方法的应用。杨传和(1990)的1D7抗体IC5tl是180ng/mL，和T-2的限量标准比较其灵敏度比较低，样品检测时需要繁琐的萃取净化方法才能达到检测要求，需要较长的样品处理时间，不利于快速筛选。可见，现有抗体的灵敏度和特异性都较差，不能完全满足T-2和HT-2毒素的检测要求。因此，制备出特异、灵敏的单克隆抗体，简化提取净化方法，更好地检测谷物和饲料中的T-2毒素和HT-2毒素具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种能识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体和检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法与试剂盒。本专利技术还提供所述单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。上述目的是通过以下技术方案实现的 一种能同时识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201189的杂交瘤细胞T-2所分泌的。所述的杂交瘤细胞T-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO C201189。所述的单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用。包含所述的单克隆抗体的试剂盒。所述的试剂盒是检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。进一步，本专利技术提供了一种检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法，其步骤如下(I)将T-2毒素与戊二酸酐(HG)反应后的产物(T-2HG)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(T-2HG-BSA)；(2)将T-2毒素与丁二酸酐(HS)反应后的产物(T-2HS)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(T-2HS-0VA)；(3)利用步骤(I)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO C201189的杂交瘤细胞T-2 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201189的杂交瘤细胞T-2制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体(如酶标板)；(6)将待测样品用体积百分比为50%的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液提取、滤纸过滤、样品稀释液稀释得到待测物；(7)对步骤(6)的待测物进行检测；其中，样品稀释液的组分及配比为=NaCl8. 0g, KH2PO4O. 2g，Na2HPO4 12H20 2. 9g，KCl0. 2g,加双蒸水至lOOOmL。所述的酶联免疫方法在T-2和HT-2毒素检测中的应用。本专利技术的有益效果是(I)本专利技术制备的单克隆抗体能够识别T-2毒素和HT-2毒素2种单端孢霉烯族毒素，IC50值分别为I. 46 u g/L和26. 26 u g/L,识别灵敏度高，抗体特异性好；(2)本专利技术建立的酶联免疫方法及试剂盒可用于检测谷物、饲料中的T-2和HT-2毒素，检测灵敏度、精密度高、准确性好；(3)合成步骤少，样品处理方法简单，利于快速筛选。附图说明图I为本专利技术的技术路线图。图2为本专利技术的单克隆抗体与T-2毒素标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为T-2毒素标准溶液浓度对数值,Y轴为T-2毒素标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。 实施例I免疫原和包被原的制备半抗原的合成10mg的T-2毒素溶于0. 4ml吡啶中，加入21Omg的HG(或HS)，蒸汽浴下搅拌反应4h。反应结束后氮气吹干溶剂，将反应物重新溶解在5ml的氯仿中，并用5ml水洗4遍，然后再将其氮气吹干，产物即T-2HG (或T-2HS)。将产物转移到0. 2ml DMF,加入10倍摩尔浓度的碳二亚胺(DCC)与5倍摩尔浓度的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌Ih，氮气吹干。免疫原的合成将半抗原T-2HG转入0. 2ml的DMF中，将反应液逐滴滴加到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能同时识别T？2和HT？2毒素的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC？NO：C201189的杂交瘤细胞T？2所分泌的。
【技术特征摘要】
1.一种能同时识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCCNO C201189的杂交瘤细胞T-2所分泌的。2.权利要求I所述的杂交瘤细胞T-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO C201189o3.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用。4.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒。6.权利要求4或5所述的试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。7.一种检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法，其步骤如下 (1)将T-2毒素与戊二酸酐反应后的产物与牛血清白蛋白偶联得到免疫原； (2)将...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，常芳芳，彭大鹏，王玉莲，陈冬梅，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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