本发明专利技术公开了一种黄瓜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于黄瓜疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种黄瓜疫霉菌的LAMP引物，见SEQNO.1-SEQNO.4。经过恒温扩增和加入SYBRgreenⅠ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明专利技术的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中黄瓜疫霉菌感染的植株和土壤中黄瓜疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为黄瓜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种黄瓜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于黄瓜疫霉菌高灵敏度快速分子检测 ，同时可用于田间黄瓜疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治
技术介绍
黄瓜疫霉iPhytophthora me I on is Kat sura)由 Katsura 在 1968 年首次从摧病的黄瓜上分离得到，并鉴定为新种，随后中国、日本、埃及、土耳其、韩国、印度等国也相继报道此病原。由该菌引起的黄瓜疫病是中国黄瓜产区发生最严重的病害之一，主要为害植株的茎、叶及果实，从苗期到成株期均可发生。该病菌存活于土壤之中，潜育期短，传播速度快，侵染力强，对植物破坏性大。温湿度适合的情况下在极短时间内可导致病害大流行，因疫病为害而损失的黄瓜产量高达80%。黄瓜疫霉能侵染黄瓜、西葫芦、哈密瓜、冬瓜等作物。对发病植物进行快速准确的病害诊断、对无病植物材料和植物生长环境中病原菌的及时检测和监测是控制植物病害发生、流行和成灾的重要基础。因此建立黄瓜疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。目前对黄瓜疫霉菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，传统的病原菌检测技术是在分离得到病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成。而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率低，难以满足对黄瓜疫病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套快速、灵敏、准确的黄瓜疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了 PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,简称 LAMP)是 2000 年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物,利用一种链式置换活性的DNA聚合酶(fci DNA polymerase),在恒温条件下(60 - 650C )保温30 - 90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增IO9 - 101°倍产物。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，黄瓜疫霉菌的检测国内外均未见报道
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中黄瓜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种黄瓜疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的黄瓜疫霉菌的快速检测方法。实现本专利技术的目的包括下列步骤 1.LAMP引物的设计 我们从GenBank中下载黄瓜疫霉Ypt (登录号EF649778)基因序列，根据黄瓜疫霉Ypt基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’·FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’ 2.黄瓜疫霉菌快速检测体系的建立LAMP 检测25ul 反应体系中 F3 与 B3 各 O. 2-0. 25uM, FIP 与 BIP 各 I. 5-1. 7uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, O. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，10_50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在 60-65°C温育 30-90 min，80°C保温 5-lOmin。更优选地，25ul反应体系中 F3 与 B3 各 O. 2uM，FIP 与 BIP各 L 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育 60 min,80°C保温 IOmin0所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法在LAMP反应的最终扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法取2ul PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。该方法可用于带菌的植株和土壤的高灵敏度快速检测。建立黄瓜疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于黄瓜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。 本专利技术的关键性技术是黄瓜疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证黄瓜疫霉菌的特异弓I物序列，本专利技术以我国福建、广东、江苏等省的36株黄瓜疫霉菌和22种不同真菌及11种疫霉属和腐霉属卵菌为供试材料，采用CTAB法提取组织中黄瓜疫霉菌的DNA。具体方法如下取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于I. 5ml离心管中，加入900ul 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取液(提取液的配方为2% CTAB ；100 m mo I/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，PH 8. O ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，pH8. O ；1.4mol/L NaCl)和90ul 10% SDS (十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55 60°C水浴I. 5 h,每10 min振荡混勻一次，水浴I. 5h后离心(12，OOOrpm) 15min,取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)，离心(12, OOOrpm) 5min,取上清液(水相),加入与上清液等体积的氯仿抽提一次(12，OOOrpm)离心5min,吸上清(350ul)，加0. I体积(35ul)的3mol/L NaAC溶液和2体积(700ul)的冰无水乙醇，-20°C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄瓜疫霉菌的LAMP引物，其特征在于：所述LAMP引物如下：F3：5’？AAATTCGCACGATCGAGCT？3’？；B3：5’？CCGTGACGTCGTACACCA？3’；FIP：5’？GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG？GACGGCAAGACCATCAAGC？3’；BIP：5’？CTATTGTAGTGGGACACGGCCG？CGATAATACCGTGGGCACC？3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李本金，陈庆河，翁启勇，兰成忠，刘裴清，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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