一种霉菌毒素浓度检测方法技术

本发明专利技术公开了一种霉菌毒素浓度检测方法，包括如下步骤：取待测霉菌毒素结晶母液回收乙醇后的废水，降至常温，用盐酸将pH调至4‑5之间，按0.05‑0.07亿霉菌毒素单位/升树脂量·小时的速度通入装有CD180树脂的树脂柱动态吸附，树脂柱的高/径为3‑5：1，采用薄层层析法检测解析液成分，有霉菌毒素B漏吸时停止吸附；水洗树脂至硝酸银测定无C1离子，水洗结束。本发明专利技术首先霉菌毒素进行提取，在进行浓度检测，对试验条件要求不高，施行方便，成本低。

Method for detecting mycotoxin concentration

The invention discloses a mycotoxin concentration detection method, which comprises the following steps: measuring wastewater, crystallization of mycotoxin mother liquor recovery after ethanol to room temperature, using hydrochloric acid pH to 4 5, according to the 0.05 7 million mycotoxin units / liter per hour speed through the amount of resin into the resin column with dynamic adsorption CD180 resin, the resin column height / diameter of 3 5:1, detected by thin layer chromatography analytical solution composition, stop adsorption of mycotoxins B leakage of suction; Determination of C1 ion washing resin to silver nitrate, washing end. The present invention has the advantages that: firstly, the mycotoxin is extracted, the concentration is detected, the test conditions are not required, the implementation is convenient, and the cost is low.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测方法，具体是一种霉菌毒素浓度检测方法。
技术介绍
霉菌是一种多细胞微生物，广泛存在于自然界中，在微生物学上属于真菌。其通过孢子的形式繁衍。霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的有毒有害物质。在土壤中，在植物上，包括谷物、饲草和青贮饲料均可发现霉菌毒素。高温高湿的环境条件通常有利于饲料中霉菌的生长和霉菌毒素的产生。迄今为止已经分离和鉴定出来的霉菌毒素有300多种。一般而言，霉菌毒素主要是由4种霉菌属所产生：曲霉菌属(主要分泌黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等)、青霉菌属(主要分泌橘霉素等)、麦角菌属(主要分泌麦角毒素)、镰孢菌属(主要分泌玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T－2毒素、串珠镰孢菌毒素)，也是最见的几种霉菌毒素。霉菌毒素对动物的危害是世界性的问题，霉菌大多属于中温型微生物，最适宜生长温度一般为20～30℃，霉菌繁殖产毒的最适温度为25～30℃，其中曲霉菌属最适宜生长温度为30℃，青霉属为28℃左右，镰刀菌一般为20℃左右，一般危害饲料的霉菌孢子在7℃时即可发芽，温度高于49℃时霉菌会被杀死或进入孢子阶段。霉菌毒素的危害主要体现在两方面，第一养禽业：种禽摄入霉变饲料容易出现产蛋下降、受精率下降、孵化率下降；子代生长不良，发生肠道综合症且难以控制。肉鸡摄入霉变饲料后，机体容易出现腹水、肾肿、生长不良等症状，还会导致疫苗免疫失败，容易诱发新城疫、传支、流感等病毒性传染病，临床难以控制。第二方面人类健康：霉菌毒素在畜产品中的残留会对人体健康产生影响。目前霉菌毒素已成为食品安全的最大隐患，影响到人类健康。畜禽食品被污染后，人食用会发生急、慢性中毒，或出现致畸、致癌、致突变。中国是农业大国，但中国种殖业比重较大的是农户散养或者小型养殖场养殖，规模分散，植物霉菌毒素类疫病防治水平和生产管理能力落后，在发生疫病流行时，难以有效控制。存在着作物领域监管对像种类多、数量大、分布广、规模不一等问题，尤其作物环节中具有极强的隐蔽性和时间性的特点，现场执法检查如果靠眼面检查从根本上不能积习难改现其问题和隐患。传统实验检测也存在程序复杂、检测时间长的技术问题，检测结果出来后产品已经销售或转移，无法及时处理，无法满足现场检测需要及时、高效、快速的需要。而且，目前成熟的快速检测技术大多是针对单一疫病或者药物残留进行，也难以达到对检测样品种类多样、检测项目繁多的检测的目的。随着生物技术的发展，开始用生物技术来对植物疫病、植物产品质量进行安全检测。比如PCR检测法、酶联免疫法(ELISA)和操作比较简单的动物疫病免疫层析检测方法，PCR检测法常用于核酸方面的检测，敏感度好且准确性相对较高，酶联免疫法常用于检测兽药残留及动物疫病，具有特异性和灵敏度比较高的优点，对于现场初筛有较好的应用前景，但这两者都需要专业的仪器设备和操作人员进行检验操作，对试验条件要求较高，施行不方便，成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种霉菌毒素浓度检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种霉菌毒素浓度检测方法，包括如下步骤：(1)取待测霉菌毒素结晶母液回收乙醇后的废水，降至常温，用盐酸将pH调至4-5之间，按0.05-0.07亿霉菌毒素单位/升树脂量·小时的速度通入装有CD180树脂的树脂柱动态吸附，树脂柱的高/径为3-5：1，采用薄层层析法检测解析液成分，有霉菌毒素B漏吸时停止吸附；水洗树脂至硝酸银测定无C1离子，水洗结束；然后用浓度为1.0mol/L、流速按每小时树脂体积的0.6倍的氨水解析，当解析液单位低于300U/ml时，停止解析，收集解析液，得到含少量杂质、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液，经测定其中含杂质占10-15％，霉菌毒素A占50-55％，霉菌毒素B占20-35％；(2)将步骤(1)得到的混合解析液用盐酸调pH3-4之间，测定解析液的单位，按解析液单位总亿数乘以4-5再除以每毫升树脂的吸附容量，以此来确定CD180树脂的用量，每毫升树脂的吸附容量为10-12万单位，将上述量树脂投入分离柱，分离柱的高径比10-20：1，按每小时0.08-0.12倍树脂体积的流速通入解析液进行吸附，解析液通完吸附完毕；用水洗树脂至硝酸银测定无Cl离子，然后用浓度为0.2mol/L氨水按每小时树脂量的0.04-0.06倍的流速解析，检测解析液的单位，解析过程中检测到解析液中出现杂质时开始收集含杂质的解析液，检测到解析液中出现霉菌毒素A时停止收集含杂质的解析液而开始收集含霉菌毒素A的解析液，检测到解析液中出现霉菌毒素B时停止收集含霉菌毒素A的解析液而开始收集含霉菌毒素B的解析液，当解析液单位低于300U/ml时，停止解析，含霉菌毒素B的解析液收集完毕；(3)将能够特异性识别霉菌毒素的核酸适配体P1和模板DNA片段P混合，P1的3’端碱基与P的3’端互补结合形成P-P1；（4）待测样品中的霉菌毒素与核酸适配体P1结合，使得P1与P分开；（5）加入外切酶Ⅲ，外切酶Ⅲ作用于体系中的P-P1，将P序列中与下游引物互补端的DNA序列切断，使P不能进行PCR扩增循环，但却不能剪切游离的P，P作为模板在下游引物P2的作用下，进行PCR扩增；（6）通过检测Ct值确定霉菌毒素的量。作为本专利技术进一步的方案：所述的模板DNA片段P、核酸适配体P1、下游引物P2的序列具有如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤(2)中分离柱的高径16-18：1。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术首先霉菌毒素进行提取，在进行浓度检测，对试验条件要求不高，施行方便，成本低。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本专利技术实施例中，一种霉菌毒素浓度检测方法，包括如下步骤：(1)取待测霉菌毒素结晶母液回收乙醇后的废水，降至常温，用盐酸将pH调至4-5之间，按0.05-0.07亿霉菌毒素单位/升树脂量·小时的速度通入装有CD180树脂的树脂柱动态吸附，树脂柱的高/径为3-5：1，采用薄层层析法检测解析液成分，有霉菌毒素B漏吸时停止吸附；水洗树脂至硝酸银测定无C1离子，水洗结束；然后用浓度为1.0mol/L、流速按每小时树脂体积的0.6倍的氨水解析，当解析液单位低于300U/ml时，停止解析，收集解析液，得到含少量杂质、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液，经测定其中含杂质占10-15％，霉菌毒素A占50-55％，霉菌毒素B占20-35％；(2)将步骤(1)得到的混合解析液用盐酸调pH3-4之间，测定解析液的单位，按解析液单位总亿数乘以4-5再除以每毫升树脂的吸附容量，以此来确定CD180树脂的用量，每毫升树脂的吸附容量为10-12万单位，将上述量树脂投入分离柱，分离柱的高径比10-20：1，按每小时0.08-0.12倍树脂体积的流速通入解析液进行吸附，解析液通完吸附完毕；用水洗树脂至硝酸银测定无Cl离子，然后用浓度为0.2mol/L氨水按每小时树脂量的0.04-0.06倍的流速解析，检测解析液的单位，解析过程中检测到解析液中出现杂质时开始收集含杂质的解析液，检测到解析液中出现霉菌毒素A时停止收集含杂质的解析液而开始收集含霉菌毒素A的解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种霉菌毒素浓度检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取待测霉菌毒素结晶母液回收乙醇后的废水，降至常温，用盐酸将pH调至4‑5之间，按0.05‑0.07亿霉菌毒素单位/升树脂量·小时的速度通入装有CD180树脂的树脂柱动态吸附，树脂柱的高/径为3‑5：1，采用薄层层析法检测解析液成分，有霉菌毒素B漏吸时停止吸附；水洗树脂至硝酸银测定无C1离子，水洗结束；然后用浓度为1.0mol/L、流速按每小时树脂体积的0.6倍的氨水解析，当解析液单位低于300U/ml时，停止解析，收集解析液，得到含少量杂质、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液，经测定其中含杂质占10‑15％，霉菌毒素A占50‑55％，霉菌毒素B占20‑35％；(2)将步骤(1)得到的混合解析液用盐酸调pH3‑4之间，测定解析液的单位，按解析液单位总亿数乘以4‑5再除以每毫升树脂的吸附容量，以此来确定CD180树脂的用量，每毫升树脂的吸附容量为10‑12万单位，将上述量树脂投入分离柱，分离柱的高径比10‑20：1，按每小时0.08‑0.12倍树脂体积的流速通入解析液进行吸附，解析液通完吸附完毕；用水洗树脂至硝酸银测定无Cl离子，然后用浓度为0.2mol/L氨水按每小时树脂量的0.04‑0.06倍的流速解析，检测解析液的单位，解析过程中检测到解析液中出现杂质时开始收集含杂质的解析液，检测到解析液中出现霉菌毒素A时停止收集含杂质的解析液而开始收集含霉菌毒素A的解析液，检测到解析液中出现霉菌毒素B时停止收集含霉菌毒素A的解析液而开始收集含霉菌毒素B的解析液，当解析液单位低于300U/ml时，停止解析，含霉菌毒素B的解析液收集完毕；(3)将能够特异性识别霉菌毒素的核酸适配体P1和模板DNA片段P混合，P1的3’端碱基与P的3’端互补结合形成P‑P1；（4）待测样品中的霉菌毒素与核酸适配体P1结合，使得P1与P分开；（5）加入外切酶Ⅲ，外切酶Ⅲ作用于体系中的P‑P1，将P序列中与下游引物互补端的DNA序列切断，使P不能进行PCR扩增循环，但却不能剪切游离的P，P作为模板在下游引物P2的作用下，进行PCR扩增；（6）通过检测Ct值确定霉菌毒素的量。...

【技术特征摘要】
1.一种霉菌毒素浓度检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取待测霉菌毒素结晶母液回收乙醇后的废水，降至常温，用盐酸将pH调至4-5之间，按0.05-0.07亿霉菌毒素单位/升树脂量·小时的速度通入装有CD180树脂的树脂柱动态吸附，树脂柱的高/径为3-5：1，采用薄层层析法检测解析液成分，有霉菌毒素B漏吸时停止吸附；水洗树脂至硝酸银测定无C1离子，水洗结束；然后用浓度为1.0mol/L、流速按每小时树脂体积的0.6倍的氨水解析，当解析液单位低于300U/ml时，停止解析，收集解析液，得到含少量杂质、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液，经测定其中含杂质占10-15％，霉菌毒素A占50-55％，霉菌毒素B占20-35％；(2)将步骤(1)得到的混合解析液用盐酸调pH3-4之间，测定解析液的单位，按解析液单位总亿数乘以4-5再除以每毫升树脂的吸附容量，以此来确定CD180树脂的用量，每毫升树脂的吸附容量为10-12万单位，将上述量树脂投入分离柱，分离柱的高径比10-20：1，按每小时0.08-0.12倍树脂体积的流速通入解析液进行吸附，解析液通完吸附完毕；用水洗树脂至硝酸银测定无Cl离子，然后用浓度为0.2mol/L氨水按每小时树脂量的0.04...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋韦艳，刘金杰，吴敏芳，徐静，赵春城，胡勇，朱倩倩，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32