一种体外检测活动性结核的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外检测活动性结核的方法。所述方法是基于定量检测结核相关因子IFN‑γ和IL‑2的试剂在体外检测结核中的应用。与现有的活动性结核检测方法相比，这一方法在活动性结核的判断结果上更准确、特异性更高。与现有的金标准痰培养相比，检测时间大大缩短，为临床医生及时诊断病人、指导用药提供了依据，对结核病的控制具有非常积极的意义。本发明专利技术中所述试剂用于检测的结核病是针对所有结核病，包括肺结核、淋巴结核、肠结核、骨结核、肾结核等，覆盖面和实用性更广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测领域，具体涉及一种体外检测活动性结核的方法。
技术介绍
结核病是一种常见的由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。目前全球有近1/3的人已感染结核杆菌，统计数据表明在2013年有150万人死于结核病，900万新发病例，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗之前，1名结核病患者一年中通过密切接触可传染多达10-15人。结核病的传播方式为经呼吸道传播，在肺结核病人的肺中有大量的结核杆菌，如果他对着健康人群咳嗽或打喷嚏的话就很有可能将病菌传播给健康人。而在未发现病患前，病人未采取任何预防手段，在与家庭成员、同事、同学等密切接触的过程中，接触者就容易被结核菌感染。现阶段结核病的主要治疗方法主为药物治疗，但是这样的治疗不能够完全阻止结核病的传播。接种卡介苗(BCG)是目前国际公认的最有效预防结核病的免疫方法，中国的计划免疫接种程序中规定新生儿须接种卡介苗，但是其保护效率也并未达到100％，因此，预防结核病的首要措施是尽早发现隐藏在人群中的新发病人。目前临床常用于活动性结核诊断的方法中，影像学方法特异性差，诊断过程与医生的经验紧密相关，诊断结果带有较强的主观性；痰培养方法是结核诊断金标准，但敏感性低，且耗时长(2-8周)，不利于结核的早期诊断；抗酸染色法敏感性仅有20-30％；分子诊断方法(如PCR)重复性差，且操作繁琐，对实验室环境有一定的要求；结核菌素试验(TST)易受卡介苗(BCG)接种的影响，造成检测结果的假阳性。近年来出现了以T细胞为基础的γ-干扰素释放试验，但是该方法仅能判断患者是否感染了(过)结核分支杆菌，无法判断是否为活动性结核。以上检测方法中，痰培养、抗酸染色法和分子诊断方法虽然特异性好，但仅针对结核病患者中的菌阳结核(约占30％)而不能诊断菌阴结核，目前临床上仍然缺乏一种直接的方法对活动性结核进行检测。结核分枝杆菌是一种典型的胞内感染菌，人体对其免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫。结核分枝杆菌侵入人体后，在机体免疫力低下的时候，巨噬细胞不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，但可将吞噬的结核分枝杆菌带到他处，提呈抗原，此时结核分枝杆菌大量繁殖，使周围T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞可产生多种细胞因子(如INF-γ、IL-2与TNF-α等)，这些细胞因子共同作用，杀死病灶中的结核分枝杆菌。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术通过大量的筛选实验，发现经过特异性刺激抗原诱导的外周血单个核细胞所分泌的细胞因子中IFN-γ和IL-2与病人的疾病状态有密切的联系，通过检测这两个因子的分泌量可对患者是否为活动性结核进行准确判断，更有利于临床医生对病人的疾病状态及时做出诊断。本专利技术所采取的技术方案是：定量检测结核相关因子IFN-γ和IL-2的试剂在体外检测结核中的应用。优选的，定量检测试剂包括酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、化学发光法、液态芯片法所用的试剂。优选的，结核为活动性结核。优选的，活动性结核包括肺结核、活动性淋巴结核、活动性肠结核、活动性骨结核、活动性肾结核等。一种体外检测活动性结核的方法，使用特异性刺激抗原体外诱导外周血单个核细胞，使其产生结核相关因子，通过检测其中IFN-γ和IL-2的分泌量，判断样本是否为活动性结核，该方法不用于疾病诊断。优选的，特异性抗原包括ESAT-6、CFP-10和Rv1985c三种蛋白的至少一种，形式选自这三种蛋白的融合蛋白、蛋白混合物或肽段。优选的，检测所用的方法包括酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、化学发光法、液态芯片法。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术提供了一种有效判断活动性结核的方法，该方法通过刺激外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子，检测其中IFN-γ和IL-2的分泌量并进行分析，得出结论。与现有的活动性结核检测方法相比，这一方法在活动性结核的判断结果上更准确、特异性更高。2)本专利技术提供的活动性结核检测方法与现有的金标准痰培养相比，检测时间大大缩短，为临床医生及时诊断病人、指导用药提供了依据，对结核病的控制具有非常积极的意义。3)本专利技术中所述试剂用于检测的结核病是针对所有结核病，包括肺结核及肺外结核(如淋巴结核、肠结核、骨结核、肾结核等)，覆盖面和实用性更广。附图说明图1为ELISA检测IFN-γ和IL-2的分泌水平；图2为ELISPOT检测IFN-γ和IL-2的分泌水平；图3为ELISA检测IFN-γ、IL-2和IL-10的分泌水平。具体实施方式活动性结核：是指患有结核病，证明有结核分枝杆菌排出，病灶属于活动期，胸片上常有斑片状阴影或是结核空洞，或者播散病灶，说明结核分枝杆菌繁殖活跃，毒力强。活动性结核患者是结核病的主要传染源，如不能及时诊断治疗，会造成结核病的大范围传播，快速准确的检出活动性结核患者是降低结核病发病率及病死率的关键。活动性结核包括但不限于活动性肺结核、活动性淋巴结核、活动性肠结核、活动性骨结核、活动性肾结核。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1：密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)使用新鲜肝素锂或肝素钠的采血管无菌抽取待检人员外周静脉血4-5ml，颠倒使抗凝剂和血液混匀待用。准备2个15ml离心管，分别加入与采血量等体积的注射用生理盐水和淋巴细胞分离液。将新鲜肝素抗凝血与生理盐水混匀后，匀速缓慢加入到分离液中，加入时需保持分离液与血液分层，然后于22℃、1800g离心20min，离心后可见PBMCs细胞存在于云雾状层中。吸取PBMCs细胞层至新的15ml离心管内，用RPMI-1640培养液补齐至12ml，于22℃，600g离心10min。倒掉上清，用RPMI-1640培养液补齐至5ml，轻轻吹打沉淀重悬后，于22℃，350g离心10min。弃上清，加入0.5ml无血清培养基重悬细胞。采用台盼蓝染色手工计数法或使用合适的设备自动计数。根据计数结果，用无血清培养基将其稀释为所需浓度的PBMC细胞悬液。实施例2酶联免疫吸附法(ELISA)检测临床诊断活动性结核患者和健康人的诱导后PBMC分泌IFN-γ和IL-2的水平1)选取10例临床诊断为活动性结核的患者和10例健康人的肝素钠抗凝外周静脉血样本，按实施例1中的密度分层法分离PBMC，经过细胞计数后使用无血清培养基将PBMC稀释到2.5×106个/ml的浓度，将细胞接种至96孔板中，每孔加入2.5×105个细胞，再加入用无血清培养基稀释的特异性刺激抗原(融合蛋白CFP-10-ESAT-6-Rv1985c，浓度2μg/ml)，37℃、5％CO2条件下孵育18小时，取细胞培养液进行IFN-γ和IL-2细胞因子的检测。2)采用预先包被了抗人IFN-γ单克隆抗体的ELISA板，加入上步所提细胞培养上清液，室温孵育2小时，用洗涤缓冲液清洗ELISA板3-5次，往检测孔中加入抗IFN-γ抗体，室温孵育1小时，然后去除抗体，用洗涤缓冲液清洗ELISA板3-5次，再加入HRP标记的二抗，37℃孵育1小时，然后去除二抗，用洗涤缓冲液清洗ELISA板3-5次，加入配制好的TMB显色底本文档来自技高网...

【技术保护点】
定量检测结核相关因子IFN‑γ和IL‑2的试剂在体外检测结核中的应用。

【技术特征摘要】
1.定量检测结核相关因子IFN-γ和IL-2的试剂在体外检测结核中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：定量检测试剂包括酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、化学发光法、液态芯片法所用的试剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：结核为活动性结核。4.一种体外检测活动性结核的方法，其特征在于：使用特异性刺激抗原体外诱导外周血单个核细胞，使其产生结核相关因子，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，胡鹏男，李妍，
申请(专利权)人：广州迪澳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44