本发明专利技术公开了一种超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，利用特异性设计的引物和探针，优化扩增体系和条件，能在同一体系同时完成KPC和NDM两个基因的检测，较单重荧光定量PCR更加高效、省时省力，本方法特异性好、重复性佳、灵敏性高，且可以利用已建立的标准曲线对未知样本进行定量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光定量PCR
，特别涉及检测超级细菌耐药基因的双重荧光定量PCR技术及其试剂盒。
技术介绍
碳青霉烯是有着广谱抗菌活性的一类β -内酰胺类抗生素，常作为治疗高产Ampc和超广谱的β_内酰胺酶的革兰阴性杆菌引起的感染的最有效的药物。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌已成为医院感染的严重问题，而且耐碳青霉烯的肠杆菌细菌的报道也越来越多，这种耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌的快速传播和流行正日益成为令人担忧的全球性问题。细菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要原因是产生碳青霉烯酶，其包括Ambler 分子分类的Α、B、D三类酶。其中A类中的新增成员KPC (Klebsiella PneumoniaeCarbapenemase)和 B 类中新增成员 NDM (New Delhi metallo-β-lactamase),因其能够水解除头霉素类以外几乎所有的β_内酰胺类抗菌药物而引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注。携带有NDM或KPC基因的细菌也被称为“超级细菌”。特别是携带有NDM的“超级细菌”目前仅对替加环素和黏菌素敏感，但是前者具有毒副作用，后者只能用于治疗部分种类的细菌感染，一般不适合大规模使用而且对黏菌素耐药的多重耐药菌株目前已有报道。由NDM或KPC型的“超级细菌’感染造成的暴发流行，往往使治疗陷入无药可用的境地，给临床抗感染治疗带来极大挑战。因此及时检测NDM和KPC基因，对细菌耐药表型进行监测，控制和杜绝超级细菌的爆发流行显得至关重要。目前主要利用分子生物学技术检测携带NDM或KPC基因的超级细菌，PCR的方法更是被誉为检测的“金标准”。但普通PCR容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性或假阴性，而且普通PCR的结果判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作不够简化。目前尚缺乏一种灵敏度高、特异性好、操作简便，且能对同时对KPC和NDM基因进行联合检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法。本专利技术所采取的技术方案是 一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤 (1)提取待检样本的DNA|旲板； (2)对DNA模板进行PCR扩增，所用引物和探针序列如下 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探针 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5), KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCA TTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探针标记的荧光基团互不相同； (3)结果分析反应结束，根据待测样本的Ct值判断其是否为NDM、KPC基因阳性。上述双重荧光定量PCR扩增体系为10μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR)(2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和KPC-probe 各 O. 2μ1，ROX Reference Dye II 0· 4μ1，待检 DNA 模板或阳性对照 DNA 或阴性对照 μ ，加灭菌去离子水补足体积至20μ1。上述双重荧光定量PCR反应条件为95°C预变性20s ;然后95°C 3s，60°C 30s，反应40个循环。上述探针标记荧光为J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。所用荧光定量PCR仪为美国ABI 7500 FAST。一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探针、ROX Reference Dye II、阳性对照品、阴性对照品，其中引物和探针序列分别为 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2), NDM 基因的探针 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5), KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探针标记的荧光基团互不相同。上述阳性对照品为NDM和KPC基因阳性的DNA标本混合物，阴性对照品为灭菌去离子水。本专利技术的有益效果是 本专利技术方法能在同一体系同时完成KPC和NDM两个基因的检测，较单重荧光定量PCR更加高效、省时省力。本方法特异性好、重复性佳、灵敏性高，且可以利用已建立的标准曲线对未知样本进行定量分析。附图说明图I为特异性实验扩增曲线 图2为敏感性实验扩增曲线 图3为重复性试验扩增曲线 图4为标准曲线 图5为临床标本扩增曲线图。具体实施方式实施例I 超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法的引物和Taqman探针的设计与合成 (I)引物和探针的设计方法 在GeneBank上下载NDM和KPC基因所有亚型的序列，到目前为止NDM共六个亚型NDM-I，NDM-2, NDM-3，NDM-4，NDM-5，NDM-6 对应的 GeneBank 序列号分别是 AB614355，JF703135，JQ734687，JQ348841，JN104597, JN967644 ;KPC 共 11 个亚型分别为 KPC-2，KPC-3，KPC-4, KPC-5, KPC-6, KPC-7，KPC-8，KPC-9，KPC-10, KPC-II, KPC-12, GeneBank 序列号依次是 AY034847，AF395881, FJ473382, EU400222, EU555534, EU729727, FJ234412, FJ624872,GQ140348，HM066995，HQ641421。利用 Beacon Designer 7 软件分别针对 NDM 和 KPC 基因各亚型间保守的区域设计引物和探针，使引物或探针与模板的结合点避开突变区域。设计好的引物和探针通过01igo6. 44、DNAstar、Primer Premier5. 0等多种软件进行评估，且所有 引物在NCBI数据库(www. ncbi.nlm.nih本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）提取待检样本的DNA模板；（2）对DNA模板进行PCR扩增，所用引物和探针序列如下：NDM基因上游引物NDM？F：TTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ？ID？NO.1），NDM基因下游引物NDM？R：GGTTGATCTCCTGCTTGA（SEQ？ID？NO.2），NDM基因的探针NDM？probe：TGGCAGCACACTTCCTATCTCG（SEQ？ID？NO.3），KPC基因上游引物KPC？F：CGCAACTGTAAGTTACCG（SEQ？ID？NO.4），KPC基因下游引物KPC？R：CATGCCTGTTGTCAGATA（SEQ？ID？NO.5），KPC基因的探针KPC？probe：CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG？（SEQ？ID？NO.6）；所用探针标记的荧光基团互不相同；（3）结果分析：反应结束，根据待测样本的Ct值判断其是否为NDM、KPC基因阳性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：芮勇宇，郑芬，孙静静，王前，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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