一种多酶体系的仿生固定化方法技术

本发明专利技术是一种固定化多酶体系的工艺方法。该方法包括以下步骤是：1）前驱体溶液的制备：在室温下将TMOS（正硅酸甲酯）加入到1mmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清后再加入pH=5-9磷酸缓冲液，混匀；2）固定化酶的制备：将多酶溶液与PDADMA溶液均匀混合，得到含酶溶液A；在30℃恒温条件下，取上步预处理过的前驱体溶液加入到溶液A中，立即振荡，室温静置、离心分离后，用磷酸缓冲液清洗，剩余固体真空冷冻干燥24h即得仿生硅化的多酶。本发明专利技术制备固定化酶的方法，制备工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达85.12%；载体为TMOS，廉价易得。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于固定化酶领域，特别是ー种固定化多酶体系的エ艺方法。
技术介绍
多酶体系是指由不同的酶联合组成的一个结构和功能的整体，能够进行连续的反应催化，自然界中生物体的物质代谢就是由各种各样的多酶体系维系的，多酶体系是高效而精确的系统，常由两个或两个以上的酶组成ー个复合体。复合体中第一个酶催化的产物作为底物直接被第二个酶催化，第二个酶催化的产物又为复合体下一个酶的底物，如此进行连续的催化反应，使催化效率显著提高并有机协调着一系列酶反应之间的平衡。多酶体系在催化过程中表现出的高效率和高度协调性，为后续人工构建多酶反应体系、优化改造生物催化过程提供了借鉴。 多酶体系共固定和共反应已成为ー个活跃的研究領域，近年来已引起了国内外众多酶工程专家的极大兴趣。固定化多酶和普通固定化酶相比，具有以下优点不同酶的催化特性被有机结合起来，使得单ー酶的应用范围扩大；催化反应中，前一种酶的产物作为底物被后一种酶催化，反应过程中由于非搅拌层的存在，使得中间产物到本体溶液的扩散受阻，造成非搅拌层内底物有效浓度较高，反应速度加快，提高了固定化酶的催化效率；反应中，由于产物抑制的减少，逆反应速率大大降低，使反应更彻底。随着对多酶体系认识和不断深入的研究，多酶体系固定化成为了研究固定化技术的热点。多酶体系的固定化技术大致可分为两种，一种是以单酶固定化为基础的混合固定化酶技木，即将不同的酶分别固定在不同载体上；第二种是多酶体系共固定技术，指多酶体系中所有的酶固定在同一种载体上。混合固定化技术中酶在反应时要克服不同载体的传质屏障，所以反应受到很大的限制。多酶共固定化技术能将不同酶的特点充分发挥并相互结合起来，有效地解决了混合固定化技术中多酶间载体的传质问题，其固定方法有、交联法、包理法等。包理法是指酶分子被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。优点是制备エ艺简单，操作条件温和；包埋在聚合物中的酶不易漏出；对外界环境的缓冲作用大，可有效防止酶体的机械损伤；稳定性强，产物容易分离。关于多酶体系的固定化技术的文献报道包括文献I :Langmuir，2000，16(24)9595-9603利用静电作用，在带负电的模板上层层组装带正电的聚电解质和带负电的酶分子，将多酶体系中不同的酶分别固定于各层之间。文献2 :Radiation Physics andChemistry, 2005, 73 :91-99用聚こ烯亚胺的氨基覆盖多孔こ醛酸琼脂表面的醛基做成惰性载体，并以此为载体共价共固定化环己酮单加氧酶和葡萄糖-6_磷酸脱氢酶。文献3 :Advanced. Materials, 2007,19(20) :3142-3145 采用共沉淀的方法将ー种酶固定在 CaCO3内，再利用静电作用层层组装带负电的PSS和带正电的PAH，得到微球，将其与CaCl2混合用共沉淀法再固定另ー种酶，再层层组装形成聚电质外壳，最后去除模板可得到的固定化酶不同酶分别固定于各层中。文献4 :Chemistry-AEuropean Journal, 2009,15 (5)1104-1107以PS-PIAT嵌段共聚物为载体，将葡萄糖氧化物酶包埋于微囊内，脂肪酶固定子双亲分子形成的微囊壁中，最后通用叠氮反应将辣根过氧化物酶接于微囊表面。文献5 :Chemistry-A European Journal, 2009,15 (46) : 12600-12603 辣根过氧化物酶经过 PS (聚苯こ烯)或PMMA (聚甲基丙稀酸甲酷)修饰，合成酶亲水头，PS或PMMA为疏水尾的双亲性高分子，以此两亲高分子做载体固定化葡萄糖氧化酶，实现双酶共固定。文献6 Carbon,2009,47 :957-966以经过甲苯胺蓝修饰的多层碳纳米管为载体，实现了对葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的共固定，并验证了固定化酶和电极之间的电子转移，制得了測量低浓度葡萄糖的生物传感器。文献 7 Bioorganic&Medicinal Chemistry, 2011,19, 5071-5078 先通过对漆酶和辣根过氧化物酶的交联聚合再经过高分子电解质层层包覆实现了对这两种酶的共沉淀，并在木质素的氧化级联反应中得到应用。以上相关文献考察了多酶体系通过不同方法制备的固定化酶，所用固定化方法涉及到吸附、交联和共价结合，这些方法的局限在干吸附法游离酶用量大，且酶与载体结合 率较低，所得的固定化酶稳定性较弱；共价结合与交联法由于固定化过程中载体与酶的结合依靠化学反应实现，对酶的活性影响较大，因此探求ー种固定化效率高、对酶活性影响小的方法很重要。目前为止，文献中还未见采用仿生硅化包埋方法进行的多酶体系共固定的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供ー种操作简单、成本低廉的固定化多酶体系的方法，它是以TMOS为前躯体溶液，在PDADMA (聚ニ甲基ニ烯丙基铵)的诱导下实现多酶体系共固定的方法，该方法所用载体价廉易得，成本较低而且固定化效率较高。本专利技术解决该技术问题所采用的技术方案是一种通过仿生硅化方法固定化多酶体系的方法，包括以下步骤是I)前驱体溶液的制备在室温下将TMOS (正硅酸甲酷)加入到lmmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清后再加入pH=5-9磷酸缓冲液，混匀；其物料配比为体积比TM0S HCl溶液磷酸缓冲液=0. 6 :4. 4 :5。2)固定化酶的制备将多酶(葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶)溶液与PDADMA (6mg/mL)溶液均匀混合，其配比为体积比多酶(葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶)溶液PDADMA溶液=1: 1，得到含酶溶液A ;在30°C恒温条件下，取上步预处理过的前驱体溶液加入到溶液A中，其配比为前驱体溶液酶溶液A体积比=1:10，立即振荡，室温静置10-30min，离心分离5min后，用pH=7的磷酸缓冲液清洗，剩余固体真空冷冻干燥24h即得仿生硅化的多酶；所述的多酶溶液，是指每lmL、pH值为7的磷酸盐缓冲液中溶有0. 2-0. 4mg葡萄糖氧化酶和4mg a-淀粉酶的溶液。本专利技术的有益效果是I.本专利技术制备固定化酶的方法，受生物体内生物硅化现象的启发，采用了仿生硅化技术进行了多酶固定化，制备エ艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达85. 12% ；2.载体为TM0S，廉价易得。具体实施方式本专利技术所用的TMOS购自于天津市化学试剂研究所。本专利技术所用的葡萄糖氧化酶和a -淀粉酶均购于sigma公司。本专利技术所述的磷酸盐缓冲溶液为Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。实例I :实验所用不同pH值的缓冲液配 制方法如下母液I :称取NaH2P04_2H20固体0. lmol，溶于IOOOmL蒸馏水中得到0. lmol/L的NaH2PCM溶液；母液2 :称取Na2HP04_12H20固体0. lmol，溶于IOOOmL蒸馏水中得到0. lmol/L的Na2HPO4溶液，不同pH的缓冲溶液由母液I与母液2按ー定比例混合并用pH计校正后得到。在室温下将0. 6mL的TMOS (分析纯)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，轻轻晃动使TMOS完全溶解，溶液变的澄清后再加入5mL磷酸缓冲液(pH=5)，混匀，得到预处理过的前驱体溶液。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多酶体系的仿生固定化方法，其特征为包括以下步骤：1）前驱体溶液的制备：在室温下将TMOS（正硅酸甲酯）加入到1？mmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清后再加入pH=5？9磷酸缓冲液，混匀；其物料配比为体积比：？TMOS：？HCl溶液：磷酸缓冲液=0.6？：4.4：5；2）固定化酶的制备：将多酶（葡萄糖氧化酶和α？淀粉酶）溶液与PDADMA（6？mg/mL）溶液均匀混合，其配比为体积比：多酶（葡萄糖氧化酶和α？淀粉酶）溶液：PDADMA溶液=1:1，得到含酶溶液A；在30？℃恒温条件下，取上步预处理过的前驱体溶液加入到溶液A中，其配比为：前驱体溶液：酶溶液A体积比=1:10，立即振荡，室温静置10？30？min，离心分离5？min后，用pH=7的磷酸缓冲液清洗，剩余固体真空冷冻干燥24？h即得仿生硅化的多酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高静，王洪武，姜艳军，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：