甘蔗赤腐病菌PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及一种甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR产物的检测。本发明专利技术的甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有操作简便快速、准确性高和实用性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，属于生物

技术介绍
甘蔗赤腐病属真菌性病害，分布于世界各蔗区。病原无性阶段为铼孢炭疽菌{Colletotrichum falcatum),主要危害甘鹿鹿莖，也危害叶中脉和叶鞘，并可导致植株死亡。该病可造成甘蔗减产，因品种抗病性而不同，严重时减产可达30%以上，并导致蔗糖份显著下降，同时，蔗茎病部的红色素和蔗茎的腐烂都会严重影响糖的质量。甘蔗赤腐病菌可以分生孢子盘和菌丝体在枯叶、宿根或蔗渣中，尽管甘蔗赤腐病 菌不能由土壤传播，但在土壌中可存活1-2个月，因此，甘蔗种茎带菌和甘蔗收获后田间植株残材是病原最初的来源。蔗茎伤ロ、虫孔和生长裂缝等是病原侵入的主要通道，对于健康植株，病原主要由叶痕、根点、生长环和芽等侵入，病原借助雨水、重露水、灌溉和风进行传播。因此，在做好田间卫生的前提下，种茎是否带菌就成为该病害发生的关键，快速、准确判断种茎是否带菌就显得尤为重要。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定；另ー种是基于该病害表型症状，因为甘蔗发病后，叶片中脉、叶鞘可见赤斑，病害进ー步发展后，蔗茎纵剖时，可见蔗肉红色，部分品种还会出现中部夹杂与蔗茎垂直的白色圆形或长形斑块，并发出酸味腐，因此，采用种茎种植后，观察是否发生甘蔗赤腐病进行鉴定。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最終建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则由于甘蔗、环境条件和病原菌三者之间的互作，可能导致即使种茎中存在该病原，病害也不一定会发生，何况还需要长达几个月的漫长时间。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的甘蔗赤腐病菌检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，可用于田间甘蔗赤腐病菌的早期诊断及检测。本专利技术的甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于 I、PCR检测体系的建立PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25μ I ； PCR 扩增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 65 °C 45 S，72 °C I min，35 个循环；72 °C 8 min ;所述 10XPCR缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；所述检测引物PCR-F :5’-CTCTTGAGAGCAAGCTGCGC-3;，PCR-R :5’-GATACTCGGTTGGGTAGG-3’ ； 2、PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为440 bp的位直出现DNA条带，为甘庶赤腐病囷存在的标志。本专利技术的应用效果 本专利技术的甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有操作简便快速、准确性高和实用性好等优点。I、操作简便快速应用本专利技术方法，提取待测植株DNA、PCR扩增和常规琼脂糖凝胶电泳即可判定检测結果，无须对病原菌进行培养或田间种植鉴定，一般检测过程可在 5 6小时完成。2、准确性高传统的甘蔗赤腐病菌检测技术是根据病原物孢子的形态特征或者根据田间种植后病害表型症状鉴定来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相似种或容易受环境条件的影响，从而导致准确性不高；同时，形态学检测在近缘菌内的不同种之间可区别的特征较少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识和经验，方可作出准确的判断。而本专利技术根据甘蔗赤腐病菌的特异性序列，选择甘蔗赤腐病菌特有的一段保守序列设计特异引物，能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的检测和鉴定提供准确的靶标位点。经过与甘蔗赤腐病菌以及其它不同植物中近缘病原菌的比较，该引物的准确率高。3、实用性好直接从待测甘蔗品种中检测甘蔗赤腐病菌具有重要的实际应用价值。目前，在甘蔗品种及其种质资源交换过程中，甘蔗赤腐病菌的检测方法根据病菌培养物所产生孢子的形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定，无法满足快速检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采用直接从待测甘蔗品种中提取DNA后直接进行PCR扩增，可在5 6小时内完成对甘蔗赤腐病菌的检测。因此本方法大大提高了检测的效率。本专利技术为甘蔗赤腐病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗赤腐病菌的早期诊断及检测，对我国抗赤腐病甘蔗育种和抗赤腐病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。附图说明图I为使用甘蔗PCR-F和PCR-R检测引物鉴定6个待检测甘蔗品种中是否受甘蔗赤腐病菌侵染(即是否含有甘蔗赤腐病菌)的PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；C代表空白对照；P代表对应甘蔗品种中含有甘蔗赤腐病菌；N代表对应甘蔗品种中不含甘蔗赤腐病菌；1_6代表6个甘蔗品种。具体实施例方式为了进一步阐明本专利技术而不是限制本专利技术，以下结合实施例加以说明。实施例I甘蔗赤腐病菌PCR检测方法甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括以下步骤 I、基因组DNA的提取 (1)取5克待检测甘蔗植株的茎节或蔗肉组织，置研钵，加入液氮磨碎成粉末，并在解冻前转入50 ml的离心管中； (2)加入15ml,65で预热的SDS提取液，混匀后在65で水浴保温40 min ； (3)加8 ml 3 mo I/L KAC 混匀后，冰浴 30 min ； (4)25000 g，4で离心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4で预冷的异丙醇； (5)-20°C放置30 min后，钩出漂浮在液面的DNA，置于ー干净的I. 5 ml离心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等体积的平衡饱和酚，摇匀，12000 g，4で离心，10 min ； (6)转移上清至另ー干净的I.5 ml离心管中，加等体积的氯仿，12000 g，4で，离心10min后移出上层水相； (7)在水相中加2倍体积的无水こ醇，12000g，4で离心10 min，留沉淀，用体积浓度为70 %的こ醇清洗2次，并晾干； (8)加灭菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20で冰箱中保存备用。2、PCR检测体系的建立 PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/LMgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物 PCR-F 和 PCR-R 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于：？（1）PCR检测体系的建立：？PCR扩增体系为总体积25？μl，内含2.5？μl？10×PCR缓冲液，2.5？μl？25？mmol/L？MgCl2，0.5？μl？10？mmol/L？dNTP，10？mmol/L？的检测引物PCR？F和PCR？R各1.0？μl，1.25？U？Taq？DNA？Polymerase，20？50？ng基因组DNA，ddH2O补足到25？μl；？PCR扩增程序如下：94？℃？4？min；94？℃？1？min，65？℃？45？s，72？℃？1？min，35个循环；72？℃8？min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100？mmol/L？pH8.5？Tris？HCl，500？mmol/L？KCl和15？mmol/L？MgCl2；所述检测引物：？？？？PCR？F：5“？CTCTTGAGAGCAAGCTGCGC？3′，PCR？R：5“？GATACTCGGTTGGGTAGG？3“；？？？？（2）PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为440？bp的位置出现DNA条带，为甘蔗赤腐病菌存在的标志。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阙友雄，许莉萍，黄宁，徐景升，袁照年，罗俊，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：