本发明专利技术公开了NALP3-ASC炎症复合体及其激活抑制剂在制备朊病毒病药物中的应用。实验表明，朊病毒感染神经小胶质细胞，形成NALP3-ASC炎症复合体增强caspase-1和IL-1β的激活。炎症复合体NALP3抑制剂能够抑制NALP3和ASC表达，进而抑制caspase-1和IL-1β的激活和释放。本发明专利技术提供了NALP3-ASC炎症复合体抑制剂在筛选朊病毒病药物中的应用，通过将待测样品与朊病毒共刺激细胞，提取处理后细胞总RNA，用qPCR方法检测NALP3和ASC，根据PCR扩增结果判断样品对NALP3和ASC的mRNA表达抑制情况，从而筛选出抗Prion疾病的药物，起到预防、治疗或控制朊病毒疾病的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及NALP3-ASC炎症复合体及其激活抑制剂的制药用途，具体地，涉及NALP3-ASC炎症复合体及其激活抑制剂在制备朊病毒相关疾病的药物中的用途。
技术介绍
朊病毒(Prion)病，又称为传染性海绵状脑病(TSEs)，是ー种致死性神经退行性疾病，以脑空泡化、神经元死亡和神经小胶质细胞增生为主要特征。该病是由于细胞朊蛋白 (PrPc)构象发生了变化，转为病理型(PrPse)而引起的。PrPse具有蛋白酶抗性，含有更多的β折叠，而替代了正常的α螺旋结构。现已证实异常形态朊蛋白(PrPse)的累积是引起该病的主要原因。近年来，国内外学者针对Prion疾病靶向药物的筛选做了许多研究。如，有研究报道，阿司匹林和ERK抑制剂PR98059可以抑制PrP106_126诱导的PrPG和ERK1/2的表达，进而减轻了其对神经元的损伤作用；还有报道，根据PrP序列人工合成的ー些单克隆抗体，如anti-PrP219-232、Fab D18等，通过体内外试验发现有抑制PrPG与PrPse结合及转变的作用，进而降低PrPse的聚集；另有研究报道，由于缺乏脯氨酸的蛋白质易于形成β折叠，因此，人工合成了ー个含有3个脯氨酸残基的13肽(iPrP13)，用于细胞和小鼠试验后发现，不仅可抑制PrPG的折叠，还可阻止PrPG变成PrPse,该13肽被称为“ β折叠破坏剤”，有一定的治疗前景。还有很多Prion疾病治疗方面的研究，但探寻更有效的靶向位点与治疗手段一直是Prion疾病研究的热点与方向。在Prion感染的脑内，PrPse聚集的周围常出现激活的神经小胶质细胞，而且神经小胶质细胞的激活在朊病毒病的发病机制中起着关键性的作用。大量研究表明，PrPse积聚可导致神经小胶质细胞活化，多种细胞因子和趋化因子的表达上调，包括白介素1β (IL-Ιβ)、肿瘤坏死因子(TNF)和趋化因子(C-C motif)配体3 (CCL3)等。其中IL-1 β在免疫调控和炎性反应中发挥着重要作用。IL-I β是由胞质中无生物活性的IL-I β前体产生的，而多种刺激可以导致pro-IL-Ιβ更高水平的表达。无活性的IL-Ιβ前体可通过蛋白酶caspase-Ι的催化,转变为成熟而有活性的IL-I β。ー些研究表明，体外合成的朊蛋白神经毒性片段可激活鼠神经小胶质细胞，并导致IL-I β的生成増加。IL-I β已经证明在prion疾病中起着重要作用，尽管PrPse可以导致小胶质细胞产生IL-1 β，但是目前PrP106-126诱导释放IL-I β的机制还不清楚。炎症复合体是存在于细胞质基质中的多蛋白复合体，作为通过caspase-Ι催化激活促炎因子IL-I β和IL-18的平台。炎症复合体在天然免疫途径中发挥着重要作用，并在炎症疾病中发挥激活作用。到目前为止，确定了ー些炎症复合体，其中研究最多的是NALP3炎症复合体(NACHT，LRR和PYD结构域-含蛋白3)或者CIASl (家族性冷致的炎症综合征I)。复合体包括Nod样受体(NLR)NALP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和pro-caspase-Ι，病原相关分子模型和内源性的危险信号可以激活复合体。虽然有大量文献报道了 Prion诱导神经小胶质细胞释放IL-I β，但是没有阐明朊病毒使神经小胶质细胞呈激活状态，并释放IL-I β的机制。若能探明朊病毒诱导释放IL-I β的机制，则有助于调节朊病毒感染神经细胞后释放IL-I β的过程，筛选prion或其它神经退行性疾病中的药物治疗靶位点，为进一步制备预防或控制朊病毒病或其它神经退行性疾病的药物提供指导。
技术实现思路
本专利技术的目的在阐明朊病毒诱导释放IL-I β的机制，提供NALP3-ASC炎症复合体及其抑制剂的制药用途。 本专利技术的另一目的在于提供一种筛选抗Prion疾病药物的方法。本专利技术通过以下实验方案阐明朊病毒诱导小鼠神经小胶质细胞(BV2)释放IL-I β的机制。技术路线见图I。(I)无菌分离小鼠原代或传代小胶质细胞进行培养。(2)朊病毒攻毒小鼠原代小胶质细胞以及传代细胞，分别于3h、6h、12h、24h取细胞上清，然后用ELISA的方法检测不同时间段上清中的IL-I β的含量。(3)朊病毒攻毒细胞后提取细胞胞浆蛋白，用Western blot的方法检测有无pro-caspasel的活化产物caspaselp20片段产生。(4)用荧光定量PCR的方法检测朊病毒攻毒小胶质后，不同时间点细胞内NALP3蛋白和ASC蛋白表达量的变化。(5)分别设计针对NALP3和ASC蛋白的特异性siRNA，摸索最佳的干扰条件，以及最佳的干扰条件下NALP3基因和ASC基因的干扰效率，分别采用荧光定量PCR和westernblot的方法。(6)分别在两种SiRNA干扰效果最佳的情况下用朊病毒攻毒干扰后的细胞，然后在特定的时间点提取细胞上清进行IL-I β的ELISA检测，确定干扰这两种蛋白以后是否会引起细胞分泌IL-I β的变化。(7)干扰Nalp3和ASC蛋白后，用朊病毒攻毒，然后用荧光定量的方法检测细胞内TNF- α以及趋化因子CCL3和CXCLlO的变化情况。(8)综合以上数据，阐明NALP3-ASC炎症复合体在朊病毒引起小鼠microglia产生IL-I β中的作用，并证明NALP3-ASC炎症复合体与其它促炎因子以及趋化因子的关系。IL-I β是由caspasel活化pro-IL-l β产生的活性片段，caspasel是一种半胱氨酸蛋白酶，正常情况下以pro-caspasel的无活性形式存在于细胞质中，激活时，pro-caspasel会活化为两个活性片段ρ10和p20。IL-I β的产生需要由pro-IL-l β的存在，而pro-IL-Ιβ的产生需要另外一个通过NF-κ B的途径来产生。实验结果表明，NALP3-ASC炎症复合体能够导致pro-caspasel活化产生caspasel,活化的caspasel进而催化pro-IL-Ιβ产生IL-I β释放到细胞外，引起一系列的炎性反应。NALP3-ASC炎症复合体在prion疾病中作为一个调控因素可以影响机体炎症的发生，其在PrP106-126诱导释放IL-I β的过程中发挥促进作用，当PrP106-126刺激神经小胶质细胞时，NALP3-ASC炎症复合体促进了 caspase-Ι和IL-I β的激活。本专利技术利用SiRNA技术分别沉默NALP3和ASC蛋白后，发现IL-I β的产生显著降低。虽然基因沉默后仍有可检测到IL-I β存在，但是这可能是由于沉默不能代表完全不表达，或者是另外有别的途径导致IL-I β的产生。本专利技术还发现抑制NF-K B的激活可以抑制PrP106-126引起的NALP3和ASC表达量上升，这也证实了 NF-κ B可能作为NALP3炎症复合体的上游调节环节，对该过程起着控制性作用。在prion疾病中，已经证明感染的脑组织中促炎因子表达量增多，并不断向淀粉样物质沉积处聚集，引起局部的免疫反应。本专利技术利用siRNA技术沉默NALP3和ASC蛋白后，可以显著降低由PrP106-126引起的TNF和CCL3两种细胞因子的表达水平。进ー步地，本专利技术提供了 NALP3-ASC炎症复合体在制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.NALP3-ASC炎症复合体在制备调节朊病毒神经毒性片段PrP106_126诱导神经小胶质细胞释放IL-I β过程的药物中的用途。2.NALP3-ASC炎症复合体在制备激活caspase-Ι和IL-I β过程的药物中的用途。3.NALP3-ASC炎症复合体在制备引起BV2细胞激活过程的药物中的用途。4.NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂在制备预防和/或治疗朊病毒病药物中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂通过如下机制来实现其治疗和预防功效，朊病毒感染引起神经小胶质细胞激活，进而通过形成NALP3-ASC炎症复合体，增强了 caspase-Ι和IL-1 β的激活，所述NALP3炎症复合体激活抑制剂阻断或抑制了 NALP3-ASC炎症复合体的形成，从而起到预防、治疗或控制朊病毒疾病的作用。6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂选自NF- K B激活抑制...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨利峰，赵德明，师福山，王继红，姚皓，周向梅，尹晓敏，赵化粉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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