取代的诺罗病毒衣壳蛋白单体，其仅含有P-结构域，被称为抗原-诺罗病毒P-结构域单体，包含通过分子克隆插入到每个P-结构域单体上存在的三个表面环中的一或多个的外来抗原。所述抗原-P-结构域单体可以自发组装成八面体形式，被称为抗原-诺罗病毒P-粒子，后者由24个拷贝的抗原-P-结构域单体构成。每个取代的P-结构域单体含有1到3拷贝的外来抗原，每个抗原-P-粒子上共有24-72个抗原拷贝。所述抗原-P-粒子可用于感染了外来病毒(例如轮状病毒)的个体的诊断、免疫和治疗方法中，还可以作为外来抗原的呈递载体用于开发抗许多感染性和非感染性疾病的新疫苗。取代的诺罗病毒P-粒子可以在大肠杆菌和酵母菌中容易地产生，高度稳定并能耐受广泛的物理化学条件。改造过的诺罗病毒P-结构域单体包含插入到P-结构域单体的三个环中的一或多个环的一或多个限制酶识别位点，提供使用方便的克隆盒用于将候选外来抗原插入表面环中。P-粒子-VP8嵌合体还可以作为抗轮状病毒和诺罗病毒的双重疫苗。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及诺罗病毒(N0R0VIRUS，N0R)衣壳蛋白的P-结构域和NOR P-粒子；抗原-诺罗病毒P-结构域单体、抗原-诺罗病毒P-结构域二聚体和抗原-诺罗病毒 P-粒子分子的制备；以及它们在抗病毒药物、药物递送系统、以及疫苗开发中的用途。
技术介绍
快速发展的生物材料和生物工程领域已成为现代医学的关键组成部分。病毒蛋白笼由于其多功能性和易于形成阵列，成为建立呈递系统的理想基材。通过基因工程，自组装的病毒结构蛋白给生物材料的合成提供了优秀的平台，是外来分子以设定模式进行整合时的良好支架，其可作为疫苗或药物。近期的一个利用病毒颗粒进行抗原呈递的例子是Manayani等描述的兽棚病毒 (flock house virus, FHV)VLP与180个氨基酸的炭疽杆菌抗原插入片段构成的嵌合体。 该重组病毒样颗粒既作为炭疽抗毒素，也是炭疽疫苗的分子支架，即在单个化合物中结合了炭疽抗毒素和疫苗的功能。另一个例子是Chatterji等描述的豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus, CPMV),文中包括了紅豆花叶病毒用于抗原表位呈递和作为肽和蛋白质附着基质的用途。整个蛋白质被化学交联至通过基因工程加在二十面体CPMV颗粒外壳蛋白上的赖氨酸和半胱氨酸残基。此外，包含伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)表面抗原 (OSPA)的乙肝病毒(HBV)衣壳样颗粒(CLP)也有描述。诺罗病毒(NOR)，以前也被称为“诺瓦克样病毒”(NLV)或小圆结构病毒，在发达国家和发展中国家都是最重要的流行性急性胃肠炎的病毒病原体。这些遗传多样性的病毒包括两个主要遗传组(genogroups) (GI和GII)和大约30种基因型。NORs属于杯状病毒科 (Caliciviridae)，是二十面体的单链正链RNA病毒，其衣壳由180个拷贝的单一主要结构蛋白构成。过去，对人类NORs的生物学研究受到了阻碍，因为病毒无法有效地在细胞培养中生长，并且没有建立合适的动物模型来进行病毒复制。从疾病爆发和人类志愿者研究获得的人类粪便样本是病毒的唯一来源，但粪便中的病毒含量太低以至于用常规电子显微镜进行病毒检测是不可能的。然而，最近通过杆状病毒(主要感染昆虫的双链DNA病毒)在昆虫细胞中成功表达NOR衣壳蛋白给NORs免疫学、流行病学和病理学研究提供了有力的替代。 产生的病毒衣壳蛋白单体自组装成病毒样颗粒(VLPs)。这些VLPs与人类粪便中发现的真正病毒在形态和抗原性上没有区别，因此给免疫检测和关于受体-病毒相互作用的研究提供了一个有用的工具。重组NOR衣壳蛋白的原子结构表明，它包含180个衣壳蛋白单体组织成的90个二聚体壳微体，形成T = 3的二十面体。来自冷冻电子显微镜和X射线晶体学的数据显示，病毒衣壳蛋白折叠成两个主要结构域，N-末端壳(Shell，S)结构域和C-末端突起 (Protrusion,P)结构域。S结构域形成内壳,而P-结构域建成从内壳延伸出来或者从内壳隆起的拱形结构。形态发生研究表明，S结构域包含衣壳的内壳组装所需的元件，而P-结构域二聚体亚基之间的分子相互作用增加了衣壳的稳定性。这两个结构域是通过一个 8-10-残基(氨基酸)铰链连接在一起。P-结构域又分为Pl和P2结构域，后者位于衣壳的最外表面。与S和Pl结构域不同，P2结构域具有较高的序列变异。由于P-结构域位于病毒粒子的最外表面且包含最可变的序列，P-结构域被认为是负责与宿主的相互作用、免疫识别、受体结合和免疫反应。已经证明分离的含有铰链(但缺乏s域)的P-结构域可以体外形成二聚体，该二聚体保持与人类组织血型抗原(HBGA)受体的结合。HBGAs是复杂聚糖和相关碳水化合物的异质群体。NORs以多样化毒株特异的方式识别人类HBGAs。在HBGAs中，最常遇到的血型是ABO(ABH)和Lewis。ABH和Lewis血型系统中抗原形成使用的生物合成途径是相互关联的。人类HBGAs存在于许多类型的细胞，包括红血细胞和血管内皮细胞，以及胃肠、泌尿生殖道和呼吸道粘膜上皮细胞。它们也可能以可溶形式存在于生物液体中，比如血液、唾液、胃肠内容物和乳汁。HBGAs是由前体结构经一组糖基转移酶逐步添加单糖单位而合成的，所述糖基转移酶受到基因的控制并被称为ABO、Lewis和分泌型(secretor)基因家族。人类HBGA系统高度多态性，受到多个带有沉默等位基因的基因家庭的控制。细胞表面上有HBGAs这样的多元化分子表明可能存在对抗不断变化的外部环境的宿主防御机制。然而，HBGAs —直与一些细菌和病毒病原体的感染联系在一起，并可能为诺罗病毒提供 “对接站”。也就是说，HBGAs可以作为病原体的识别目标，并可能促进病原体进入那些表达或者形成与抗原的受体-配体键的细胞。虽然这种相互作用的确切性质目前还不清楚，抗原结合时发生的与病原体的紧密关联可能在感染过程的初始步骤中具有将病原体锚定到细胞上的作用。NORs对人类HBGAs的识别是典型的蛋白质-碳水化合物相互作用，其中病毒衣壳蛋白突起结构域与HBGA抗原的寡糖侧链形成交界面，不同毒株之间有广泛的多样性。作为只可能在肠道复制的病原体，NORs已发展出独特的策略来克服宿主防御系统。其遗传和结构的变化证实了这种独特性，这就解释了为什么NOR相关疾病如此普遍和广泛存在于全球各个人口群体。2003年12月2日出版的PCT专利出版物US2003/101176 (通过引用全文并入本文)涉及NOR毒株以几种不同组织血型模式之一与ABO和LewisHBGAs的结合。NORs对 HBGAs的识别是毒株特异性的，已确认了多种独特的HBGA结合模式。基于NORs的多样性和宿主细胞表面上碳水化合物的多态性，可能会发现更多的模式。2006年12月28日出版的PCT专利公开US2006/138，514(通过引用全文并入本文)涉及一种被称为P-粒子的小粒子，该粒子显示对HBGA有增强的结合亲和力。P-粒子是T = I的二十面体，由24个P-结构域单体组织成12个相同的P-结构域二聚体后建成。12(P_结构域二聚体)和24(P_结构域单体)均是二十面体对称的完美单元数，在植物和动物病毒中经常出现。分离的P-结构域(没有S结构域或单体衣壳蛋白的铰链)可以自发形成T = I的二十面体P-粒子，该复合体由排列成12个二聚体的24个P-结构域单体构成。P-粒子可以与相应的HBGAs结合，并揭示强烈阻断NOR VLP与HBGAs的结合。多个 NOR毒株中都观察到P-粒子的自发形成，包括VA387、MOH和诺瓦克病毒(Norwalk Virus, NV)株。NOR P-粒子可以用于NOR感染的治疗和抗NOR感染疫苗的制备。轮状病毒(RVS)和NORs是全球范围内的常见病原体，造成巨大的医疗负担。全球来说，每年< 5岁儿童中发生高达10亿起各种原因导致的肠胃炎，其中13%至25% ( I 亿3千万起)是由RV造成的。RV是儿童严重腹泻和脱水的首要原因，每年严重的RV胃肠炎造成350，000-600, 000例< 5岁儿童死亡。它还造成每年2百万儿童入院，估计超过10 亿美元的花费。另一方面，NORs是非细菌性急性胃肠炎流行病的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：江熙，谭明，
申请(专利权)人：儿童医院医疗中心，
类型：发明
国别省市：
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