用于体外制造胃底组织的方法和与其相关的组合物技术

本公开涉及用于通过定向分化将哺乳动物定形内胚层(DE)细胞转化为特定组织或器官的方法。特别地，本公开涉及由分化的定形内胚层形成的胃底组织和/或类器官的形成。

Method for manufacturing gastric fundus tissue in vitro and related compositions

The present disclosure relates to a method for transforming mammalian stereotyped endodermal (DE) cells into specific tissues or organs by directional differentiation. In particular, the present disclosure relates to the formation of gastric fundus tissues and/or similar organs formed by differentiated stereotyped endodermis.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外制造胃底组织的方法和与其相关的组合物相关申请的交叉引用本申请要求2016年5月5日提交的美国临时专利申请62/332,194的优先权和权益，所述申请的内容通过引用整体并入。政府支持条款本专利技术依据All16491和DK092456在政府支持下进行。政府具有本专利技术中的某些权利。
技术介绍
虽然胃疾病在全球流行，但是存在很少用于研究人类胃的基底上皮组织的足够模型。人类胃底类型胃类器官(hFGO)的发展将是研究人类胃生理学、病理生理学和药物发现的分子基础的新型且强力的模型系统。
技术实现思路
本公开涉及用于通过定向分化将哺乳动物定形内胚层(DE)细胞转化为特定组织或器官的方法。特别地，本公开涉及由分化的定形内胚层形成的胃底组织和/或类器官的形成。附图说明本领域技术人员将理解以下描述的附图仅出于说明性目的。附图并不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。图1.Wnt/β-连环蛋白信号传导对于小鼠中胚胎胃底的规范化是所需的。a，Pdx1和Sox2在胃窦(a)中表达，而Pdx1在胃底(f)中不存在，这通过在E18.5时的表达Atp4b的壁细胞来鉴定。b，来自Axin2：LacZ报道基因胚胎的E10.5前肠的X-gal染色显示Wnt活性局限于胃的前部区域但从后部胃被排除。c，胃上皮组织中β-连环蛋白的缺失致使Pdxl前部扩展到胃的基底区域中。d，在E18.5ShhCre/+β-连环蛋白fl/fl(cKO)胚胎中，Pdx1在整个胃中表达，在含有壁细胞的上皮组织的一些剩余的片中除外。插图1a-c和2a-c分别显示对照和cKO胃中的框内区域。e，在cKO胃中，Ctnnbl表现出嵌合体缺失，并且壁细胞仅在Ctnnb1足够的上皮组织中分化。比例尺，250μm(a)，200μm(c)，以及500μm(d和e)。图2.β-连环蛋白活化促进胃底从人类前肠祖细胞球形体发育。a，针对胃底和胃窦hGO两者的分化方案的示意图。b、c，在第9天，CHIR处理的类器官表现出PDX1减少，IRX2、IRX3和IRX5增加，并且胃标记物SOX2或GATA4没有变化。*，p＜0.05；双尾学生t测试；n＝3个生物平行测定，数据代表4个独立实验。d，hFGO与hAGO类似地成长，但是还表现出腺体出芽形态发生(白色箭头)。e，两种hGO均含有表达CDH1、KRT8和CTNNB1以及胃标记物GATA4和CLDN18的上皮组织。hAGO表现出几乎无所不在的PDX1表达，而hFGO并非如此。比例尺，50μm(c)，500μm(d)以及100μm(e)。误差条表示s.e.m.。图3.hGO中粘液和内分泌细胞谱系的分化。a，胃的胃底和胃窦腺体中存在的共有的和不同的谱系的示意图。b，胃窦和胃底hGO两者均含有MUC5AC阳性表面粘液细胞和MUC6阳性颈粘液细胞。c、d，hFGO含有表达泛内分泌标记物SYP的内分泌细胞。在hFGO中识别到各种不同的激素细胞类型，包括表达GHRL、SST和组胺的内分泌细胞。胃窦特异性G细胞标记物GAST在hAGO中表达，但是不在hFGO中表达；相反地，hFGO中富含GHRL。**，p＜0.01；双尾学生t测试；分别在hAGO和hFGO中，n＝8和24个生物平行测定，数据代表6个独立实验。e，hAGO，而不是hFGO，能够响应于促内分泌转录因子NEUROG3(+dox)的表达而产生胃窦特异性的表达GAST的内分泌细胞。*，p＜0.01；双尾学生t测试；n＝4个生物平行测定，数据代表3个独立实验。误差条表示s.e.m.。图4.hFGO中主细胞的形成。a，hFGO具有MIST1和胃蛋白酶原C(PGC)阳性细胞两者。b，高放大率的图(a)中的框内区域，显示具有顶端PGC染色的细胞集群的腺体。c，与hAGO相比，hFGO具有显著增加的主细胞标记物PGA5(1,000倍)、PGC(100倍)和MIST1(＞10倍)的表达。**，p＜0.05；双尾学生t测试。n＝3个生物平行测定，数据代表4个独立实验。d，含有密集的酶原颗粒的hFGO细胞的透射电子显微照片，指示主细胞。e，在MEK抑制剂(PD03)的存在或不存在下，与hAGO相比，在hFGO中的胃蛋白酶原蛋白含量。**，p＜0.0001，与hAGO相比，双尾学生t测试，分别在hAGO、对照hFGO和hFGO(没有PD03)中，n＝8、12和11个生物平行测定。比例尺，200μm(a)，25μm(b)，以及10μm(d)。误差条表示s.e.m.。图5.对驱动hFGO中功能性壁细胞的分化的途径的识别。a，与在基线处的胃窦相比，壁细胞基因ATP4、ATP4B和GIF的表达在hFGO中表现出10至100倍增加，但是通过将hFGO暴露于两天的PD03/BMP4脉冲而明显地增加。**，p＜0.05，与hAGO相比；#，p＜0.05，与对照hFGO相比，双尾学生t测试，n＝4个生物平行测定，数据代表15个独立实验。b，在用PD03/BMP4处理之后，对表达ATP4B的壁细胞的刺激分化。c，hFGO衍生的壁细胞与体内成熟小鼠胃底上皮组织中存在的那些相似。d，具有近似于壁细胞的小管结构的hFGO细胞的透射电子显微照片。e，人类胃底腺体的上皮组织和hFGO上皮组织被组织成表面上皮组织中的表达MUC5AC的细胞和腺体单元中的表达ATP4B的壁细胞。f，通过SNARF-5F的腔内注射，对响应于组胺的类器官中腔内pH的分析。hFGO中腔内pH快速下降，而hAGO未表现出应答。通过用法莫替丁或奥美拉唑预处理类器官来阻断酸化。分别在hFGO(组胺)、hFGO(组胺和法莫替丁)、hFGO(组胺和奥美拉唑)、以及hAGO(组胺)中，n＝9、9、7以及4个生物平行测定；数据代表三个独立实验。g，在60分钟之后，组胺在分离的小鼠胃腺中和在hFGO中诱导呈小管类型模式的吖啶橙(AO)染料积累。比例尺，100μm(b)，10μm(c)，10μm(d)，100μm(e；人类胃底)，20μm(e；hFGO)，以及10μm(g)。误差条表示s.e.m.。图6.在体内发育的胃中限定分子区域。A，对胚胎小鼠胃(E14.5)中Sox2、Pdx1和Gata4的分析显示胃底(f)是Sox2+Gata4+Pdx1-，而胃窦(a)是Sox2+Gata4+Pdxl+。前胃(fs)表达Sox2，但是既不表达Gata4也不表达Pdx1。b，明视场立体显微照片显示通过qPCR分析的E14.5小鼠胃的解剖区域。fs，前胃；f，胃底；a，胃窦；d，十二指肠。c，针对已知的区域表达的标记物(Sox2，P63，Gata4，Pdx1以及Cdx2)通过qPCR分析b中的解剖区域以验证微解剖的准确性。对解剖的E14.5胃区域的qPCR分析显示，与胃窦相比，胃底中富含推定的胃底标记物Irx1、Irx2、Irx3、Irx5以及Pitx1。n＝4个生物平行测定/解剖区域。比例尺，500μm。误差条表示s.d.。图7.对β-连环蛋白cKO胚胎的分析。a，在E12.4和E14.5之前，在整个背侧胃上皮组织以及cKO胚胎的大部分近侧胃上皮组织中观察到异常Pdx1表达。b，对E14.5cKO前肠的解剖区域(图6，b)的qPCR分析显示Pdx1在胃底和前胃区域中的显著上调。相反地，Irx2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导胃底组织形成的体外方法，其包括以下步骤：a)将哺乳动物定形内胚层(DE)细胞与wnt途径活化剂、FGF信号传导途径活化剂、BMP信号传导途径抑制剂以及视黄酸接触第一时间段；其中所述第一时间段持续足以从所述定形内胚层形成三维后部前肠球形体的时间长度；b)将所述三维后部前肠球形体在具有生长因子、所述Wnt信号传导途径活化剂、所述EGF信号传导途径活化剂、所述BMP信号传导途径抑制剂以及视黄酸的基底膜基质中悬浮第二时间段，其中所述第二时间段持续足以诱导包括胃底hGO(hFGO)的胃底谱系的时间长度；c)将步骤b)的所述hFGO用所述wnt途径活化剂和所述EGF信号传导途径活化剂培养第三时间段；d)将步骤c的所述hFGO用所述wnt信号传导途径活化剂、所述EGF信号传导途径活化剂和FGF10培养第四时间段；e)将步骤d的所述hFGO与MEK抑制剂接触第五时间段，其中所述第五时间段持续足以形成所述包含功能性胃底细胞类型的胃底组织的时间段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.05 US 62/332,1941.一种诱导胃底组织形成的体外方法，其包括以下步骤：a)将哺乳动物定形内胚层(DE)细胞与wnt途径活化剂、FGF信号传导途径活化剂、BMP信号传导途径抑制剂以及视黄酸接触第一时间段；其中所述第一时间段持续足以从所述定形内胚层形成三维后部前肠球形体的时间长度；b)将所述三维后部前肠球形体在具有生长因子、所述Wnt信号传导途径活化剂、所述EGF信号传导途径活化剂、所述BMP信号传导途径抑制剂以及视黄酸的基底膜基质中悬浮第二时间段，其中所述第二时间段持续足以诱导包括胃底hGO(hFGO)的胃底谱系的时间长度；c)将步骤b)的所述hFGO用所述wnt途径活化剂和所述EGF信号传导途径活化剂培养第三时间段；d)将步骤c的所述hFGO用所述wnt信号传导途径活化剂、所述EGF信号传导途径活化剂和FGF10培养第四时间段；e)将步骤d的所述hFGO与MEK抑制剂接触第五时间段，其中所述第五时间段持续足以形成所述包含功能性胃底细胞类型的胃底组织的时间段。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段是三天±24小时，并且其中所述视黄酸在所述时间段±24小时的第三天添加。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段是三天±24小时。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三时间段是11天±24小时。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第四时间段是10天±24小时。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第五时间段是两天时间段±24小时。7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤e)还包括将所述胃底hGO与BMP4信号传导的活化剂接触的步骤。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能性胃底细胞类型是表达质子泵蛋白并且分泌酸的壁细胞。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能性胃底细胞类型是分泌胃蛋白酶原的主细胞。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤e进行足以发育SOX2+GATA+PDXl-上皮组织的时间段。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤d和所述步骤e进行足以赋予谱系标记物MUC5...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·韦尔斯，K·麦克拉肯，
申请(专利权)人：儿童医院医疗中心，
类型：发明
国别省市：美国,US