强绝缘子和其在基因递送中的用途制造技术

一种来自泡沫病毒的强绝缘子片段，其可以用于使转基因的表达绝缘，并且减少包括此类绝缘子的整合载体的基因毒性。所述绝缘子片段也可以用于基因编辑中的基因靶向性构建体中。

Strong insulator and its application in gene delivery

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】强绝缘子和其在基因递送中的用途相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年9月18日提交的美国临时申请第62/559,751号的权益，所述申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术介绍
逆转录病毒载体(RV)已经成为基因治疗中的宝贵工具，因为它们能够进入人类宿主细胞，并且将目的基因，特别是难以递送的DNA，整合到宿主细胞中，以进行稳定的基因转移和表达。逆转录病毒载体已经有效地用于治疗性转基因的递送和整合。迄今为止，已经使用这种方法成功地治疗了多种基因疾病，例如，X连锁严重综合免疫缺陷症(X-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)、腺嘌呤脱氨酶缺乏症(ADA-SCID)和Wiskott-Aldrich综合征(WAS)(Hacein-Bey-Abina等人，《新英格兰医学期刊(N.Engl.J.Med.)》363:355-64,2010；Hacein-Bey-Abina等人，《临床研究期刊(J.Clin.Invest.)》118:3132-42,2008，Howe等人，《临床研究期刊》118:3143-50,2008，Stein等人，《自然医学(Nat.Med.)》16:198-204,2010，Ott等人，《自然医学》12:401-9,2006，Boztug等人，《新英格兰医学期刊》363:1918-27,2010)。逆转录病毒疗法的一个主要挑战是增强子介导的基因毒性或插入性肿瘤发生的高风险。如γ逆转录病毒(GV)载体和慢病毒(LV)载体等逆转录病毒载体在其长末端重复序列(LTR)的U3区中具有强大的增强子，由于宿主细胞中原癌基因的转录开始位点附近的非随机整合，这可能引起原癌基因激活。这也称为插入性激活(Maruggi等人，《分子治疗(Mol.Ther.)》17:851-6,2009)。具有3'LTRU3增强子/启动子缺失和驱动转基因表达的内部较弱的细胞/内源基因启动子的自灭活(SIN)GV和LV载体已经被用于规避通过病毒增强子的插入性肿瘤发生的风险。然而，折衷是不足以用于有效的转基因治疗或表型校正的转基因表达。因此，非常感兴趣的是开发减少逆转录病毒载体的基因毒性的新方法，所述逆转录病毒载体用于将目的基因递送到宿主细胞。
技术实现思路
本公开至少部分地基于从泡沫病毒(FV)的长末端报道(LTR)中发现的强绝缘子片段，当插入到逆转录病毒载体的LTR区中时，其显著降低了基因毒性。因此，本公开的一方面提供了一种用于基因递送的核酸构建体，所述核酸构建体包括由绝缘子片段侧接的至少一个目的基因(GOI)，其中所述绝缘子片段包括与AAGGGAGACATCTAGTGATATAAGTGTGAACTACAC(SEQIDNO:2)至少90％(例如，至少95％)相同的核苷酸序列或其互补序列(GTGTAGTTCACACTTATATCACTAGATGTCTCCCTT；SEQIDNO:1)。在一些实施例中，所述绝缘子片段与所述核酸构建体的至少一个片段异源。在一些实施例中，绝缘子片段可以包括SEQIDNO:2的核苷酸序列或其互补序列。例如，绝缘子片段可以包括SEQIDNO:2或其互补序列的单个拷贝；或SEQIDNO:2或其互补序列的多个拷贝。GOI可以编码目的试剂，其可以是蛋白质或核酸。在一些实施例中，目的试剂是治疗性蛋白质。实例包含但不限于抗体、生长因子、细胞因子、凝血因子、酶或血红蛋白。在其它实施例中，目的试剂可以是核酸。实例包含但不限于干扰RNA、反义寡核苷酸或微小RNA。在一些实施例中，绝缘子片段可以位于GOI的上游或GOI的下游。在其它实施例中，本文所述的核酸构建体可以包括绝缘子片段的至少两个拷贝。绝缘子的一个拷贝可以位于GOI的上游，并且另一个拷贝可以位于GOI的下游。在一些实例中，核酸构建体可以包括两个GOI，并且至少一个绝缘子片段位于两个GOI之间。在一些实施例中，本文所述的核酸构建体可以是载体，例如病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)。在一些情况下，病毒载体是自灭活(SIN)病毒载体。在一些实例中，载体是逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体或γ逆转录病毒载体)，其可以包括5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR。绝缘子片段可以位于5'LTR内部，3'LTR内部，或5'LTR和3'LTR两者内部。在一些情况下，绝缘子与5'LTR和/或3'LTR异源。示例性逆转录病毒载体包含但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)载体、禽白血病病毒(ALV)载体、鼠白血病病毒(MLV)载体、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)载体、鼠干细胞病毒或人T细胞白血病病毒(HTLV)载体。在一些情况下，本文所述的逆转录病毒载体中的任一个可以包括所述绝缘子片段的多个拷贝，所述多个拷贝中的至少一个位于所述5'LTR或所述3'LTR内部，并且所述多个拷贝中的至少一个位于所述GOI的上游或下游附近。本文所述的逆转录病毒载体中的任一个可以包括3'LTR，其包括上游聚腺苷酸化(polyA)增强子信号序列，例如，衍生自SV40晚期polyA信号序列的上游序列元件(USE)。在一些实例中，上游polyA增强子信号序列可以替代3'LTR中的U3区。可替代地或另外，本文公开的逆转录病毒载体可以进一步包括以下元件中的一种或多种：(i)psi(ψ)包装信号；(ii)rev应答元件(RRE)；(iii)gag元件；(iv)env剪接受体序列；(v)所述3'LTR下游的异源polyA信号序列的一个或多个拷贝；(vi)一种或多种染色质绝缘子元件(例如，鸡超敏位点4元件(cHS4))；(vii)中央多嘌呤区(cPPT)；和(viii)转录后调节元件(PRE)，如土拨鼠肝炎病毒PRE。在其它实施例中，核酸构建体可以是用于基因编辑的基因靶构建体。另一个方面，本文提供了一种用于将目的试剂递送到宿主细胞的方法，所述方法包括使宿主细胞与有效量的本文所述的核酸构建体中的任一种接触。本文还提供了一种用于将目的试剂递送到受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括由如本文所述的逆转录病毒载体产生的遗传物质的病毒颗粒。进一步，本申请提供了一种用于将外源基因整合到宿主细胞的基因组中的方法，所述方法包括(i)将DNA内切核酸酶和如本文所述的基因靶向性构建体递送到宿主细胞中，和(ii)在允许在所述宿主细胞的染色体的位点处切割，并且将所述基因靶向性构建体整合到所述染色体中的条件下，温育所述宿主细胞。用于本文描述的方法的示例性DNA内切核酸酶包含但不限于CRISPR相关的RNA引导的内切核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶。在一些实施例中，基因靶向性构建体可以包括侧接一个或多个目的基因和绝缘子片段的同源臂。同源臂与染色体的切割位点同源。本文所述的方法中的任一个可以通过向有需要的受试者施用所述核酸构建体或所述基因靶向性构建体来进行的。在一些实施例中，受试者是人类患者。又另一个方面，本公开提供了一种用于减本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于基因递送的核酸构建体，所述核酸构建体包括由绝缘子片段侧接的至少一个目的基因(GOI)，其中所述绝缘子片段包括与AAGGGAGACATCTAGTGATATAAGTGTGAACTACAC(SEQ ID NO:2)至少90％相同的核苷酸序列或其互补序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170918 US 62/559,7511.一种用于基因递送的核酸构建体，所述核酸构建体包括由绝缘子片段侧接的至少一个目的基因(GOI)，其中所述绝缘子片段包括与AAGGGAGACATCTAGTGATATAAGTGTGAACTACAC(SEQIDNO:2)至少90％相同的核苷酸序列或其互补序列。


2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段与所述核酸构建体的至少一个片段异源。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段包括与SEQIDNO:2至少95％相同的核苷酸序列或其所述互补序列。


4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段包括SEQIDNO:2的核苷酸序列或其所述互补序列。


5.根据权利要求1到4中任一项所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段包括SEQIDNO:2或其所述互补序列的多个拷贝。


6.根据权利要求1到5中任一项所述的核酸构建体，其中所述GOI编码目的试剂，所述目的试剂是蛋白质或核酸。


7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述目的试剂是治疗性蛋白质。


8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中所述治疗性蛋白质是抗体、生长因子、细胞因子、凝血因子、酶或血红蛋白。


9.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述目的试剂是核酸，所述核酸是干扰RNA、反义寡核苷酸或微小RNA。


10.根据权利要求1到9中任一项所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段位于所述GOI的上游或所述GOI的下游。


11.根据权利要求1到9中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括所述绝缘子片段的至少两个拷贝，一个拷贝位于所述GOI的上游，并且另一个拷贝位于所述GOI的下游。


12.根据权利要求1到11中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括两个GOI，并且至少一个绝缘子片段位于所述两个GOI之间。


13.根据权利要求1到12中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是载体。


14.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中所述载体是病毒载体。


15.根据权利要求14所述的核酸构建体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。


16.根据权利要求15所述的核酸构建体，其中所述载体是逆转录病毒载体，其包括5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR，其中所述绝缘子片段位于所述5'LTR内部、所述3'LTR内部、或所述5'LTR和3'LTR两者内部，并且其中所述绝缘子与所述5'LTR和/或所述3'LTR是异源的。


17.根据权利要求15或权利要求16所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段位于所述5'LTR或所述3'LTR内部。


18.根据权利要求15或权利要求16所述的核酸构建体，其中所述绝缘子片段位于所述5'LTR和所述3'LTR两者内部。


19.根据权利要求15到18中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括所述绝缘子片段的多个拷贝，所述多个拷贝中的至少一个位于所述5'LTR或所述3'LTR内部，并且所述多个拷贝中的至少一个位于所述GOI的上游或下游附近。


20.根据权利要求15到19中任一项所述的核酸构建体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。


21.根据权利要求20所述的核酸构建体，其中所述逆转录病毒载体是人免疫缺陷病毒(HIV)载体、禽白血病病毒(ALV)载体、鼠白血病病毒(MLV)载体、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)载体、鼠干细胞病毒或人T细胞白血病病毒(HTLV)载体。


22.根据权利要求15到21中任一项所述的核酸构建体，其中所述3'LTR包括上游聚腺苷酸化(polyA)增强子信号序列。


23.根据权利要求22所述的核酸构建体，其中所述上游聚腺苷酸化(polyA)增强子信号序列是衍生自SV40晚期polyA信号序列的上游序列元件(USE)。


24.根据权利要求22或权利要求23所述的核酸构建体，其中所述上游polyA增强子信号序列替代所述3'LTR中的U3区。


25.根据权利要求15到24中任一项所述的核酸构建体，其进一步包括以下元件中的一种或多种：
(ix)psi(ψ)包装信号；
(x)rev应答元件(RRE)；
(xi)gag元件；
(xii)env剪接受体序列；
(xiii)所述3'LTR下游的异源polyA信号序列的一个或多个拷贝；

【专利技术属性】
技术研发人员：P·马利克，
申请(专利权)人：儿童医院医疗中心，
类型：发明
国别省市：美国;US