使用分割型脱氨酶限制不需要的脱靶碱基编辑器脱氨制造技术

本文描述了用于改进靶向性碱基编辑技术的全基因组特异性的方法和组合物。在此，我们描述了使用分割型脱氨酶(sDA)的二聚体碱基编辑(BE)技术，所述分割型脱氨酶在彼此紧密靠近时起作用，一个与ZF融合且一个与含有一个或多个UGI的nCas9‑UGI蛋白融合，由此限制脱氨酶结构域在与nCas9 R‑环形成无关的脱靶ssDNA靶位点处的脱氨能力。因此，本文提供含有以下的融合蛋白：(i)与可编程DNA‑结合结构域融合的第一分割型脱氨酶部分("sDAI")酶；或(ii)与nCas9蛋白融合的第二分割型脱氨酶部分("sDA2")。本发明专利技术还包括载体和含有所述载体的细胞，以及含有本文所述蛋白质和核酸的试剂盒。

Use of segmented deaminase to limit unwanted deamination with the deamination base editor

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用分割型脱氨酶限制不需要的脱靶碱基编辑器脱氨优先权声明本申请要求2017年5月25日提交的美国临时专利申请系列号62/511,296；2017年8月4日提交的美国临时专利申请系列号62/541,544和2018年1月26日提交的美国临时专利申请系列号62/622,676的权益。前述文献的完整内容通过引用的方式并入。国家资助的研究或发展本专利技术借助美国政府支持在国立卫生研究院授予的授予号GM118158下做出。美国政府在本专利技术中享有某些权利。
本文中描述了用于改进靶向性碱基编辑技术的全基因组特异性的方法和组合物。
技术介绍
碱基编辑(BE)技术使用一种工程化的DNA结合结构域(如RNA指导的、无催化活性Cas9(死Cas9或dCas9)、切口酶形式的Cas9(nCas9)、或锌指(ZF)阵列)以将胞嘧啶脱氨酶结构域招募至基因组特定位置，以实现位点特异性胞嘧啶→胸腺嘧啶转换置换1,2。BE是用于治疗细胞背景下表现出的遗传疾病的特别有吸引力工具，其中通过同源介导修复(HDR)产生精确突变将是治疗有益的，但是难以由基于核酸酶的传统基因组编辑技术产生。由于HDR途径限于细胞周期的G2和S期，例如，在主要由缓慢分裂或有丝分裂后的细胞群组成的组织中难以或不可能实现HDR结果3。此外，HDR的效率可能受到非同源末端接合介导对核酸酶诱导断口(break)的修复所致竞争性和更高效诱导可变长度插入/缺失突变的大幅度限制。相反，BE技术具有允许实施者在无需细胞类型可变的DNA修复机制情况下产生高度可控、高度精确突变的潜力。
技术实现思路
碱基编辑器平台(BE)拥有在无需供体DNA分子情况下产生精确的、用户限定的基因组编辑事件的独特能力。碱基编辑器(BE)按照位点特异性方式高效诱导胞嘧啶至胸腺嘧啶(C至T)碱基转换，如通过CRISPR指导RNA(gRNA)间隔子序列确定的，其中所述碱基编辑器包含与胞嘧啶脱氨酶结构域和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)结构域(例如，BE3)融合的产生单链切口的CRISPR-Cas9(nCas9)蛋白1。与全部基因组编辑试剂一样，至关重要的是，在用于治疗药之前，首先确定然后降低BE产生脱靶突变的能力，从而限制其产生有害和不可逆基因编码副作用的潜力。这里，我们描述了使用分割型脱氨酶(splitdeaminase)(sDA)的二聚体BE，所述分割型脱氨酶在彼此紧邻时起作用，一者与ZF融合，一者与包含一个或多个UGI的nCas9-UGI蛋白融合，从而限制脱氨酶结构域在与nCas9R-环形成无关的脱靶ssDNA靶位点处脱氨的能力。因此，本文提供融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)与可编程DNA结合结构域融合的第一分割型脱氨酶部分(“sDA1”)，所述可编程DNA结合结构域优选选自由例如ZF、TALE、Cas9、无催化活性的Cas9(dCas9)或Cas9直向同源物(即，来自另一个物种的同源蛋白如dCpf1)、产生切口的Cas9(nCas9)或产生切口的Cas9直向同源物组成的组，其中sDA1是选自由hAID、rAPOBEC1、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、或hAPOBEC3H、及其变体(例如，具有改变的底物特异性或活性的变体如eA3A)组成的组的亲本脱氨酶的N端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；或(ii)第二分割型脱氨酶部分(“sDA2”)，其例如以类似于前述碱基编辑器结构的方式与nCas9蛋白、优选nCas9-UGI蛋白、或如用于其互补性sDA1部分的任何正交DNA靶向性结构域(例如，dCpf1、TALE、ZF)融合，其中sDA2是选自由hAID、rAPOBEC1*、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G或hAPOBEC3H、和/或其变体(例如，具有改变的底物特异性或活性的变体如eA3A)组成的组的亲本脱氨酶的C端截短、无催化活性或缺陷型衍生物。在本方法中，分割型脱氨酶不是全长蛋白质，而是其片段，其中在真核细胞中包含来自相同亲本脱氨酶的sDA1部分和sDA2部分的融合蛋白(i)与融合蛋白(ii)的共表达、和它们后续在邻近基因组靶位点处的共定位，提供具有催化活性的碱基编辑器。术语“sDA1”和“sDA2”在本文中通常用来指第一分割型脱氨酶和第二分割型脱氨酶，并且不专门指本文所述的示例性分割型脱氨酶。本文还提供编码本文所述的融合蛋白的核酸和包含这些核酸中一者或多者的组合物，例如，其中核酸编码例如包含来自相同亲本脱氨酶的SDA1和SDA2部分的融合蛋白对。此外，本文还提供包含这些核酸的载体和包含并任选表达这些核酸的分离的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是干细胞，例如，造血干细胞。此外，本文提供使核酸中一个或多个所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法。这些方法包括使核酸与本文所述的包含来自相同亲本脱氨酶的SDA1和SDA2部分的融合蛋白对、以及一种或多种与融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA接触。在一些实施方案中，融合蛋白之一包含nCas9，另一融合蛋白包含ZF或TALE，并且使ZF或TALE靶向与针对nCas9的gRNA的靶位点邻近的9-24bp序列，其中gRNA与包含所选胞嘧啶的核酸结合。在一些实施方案中，核酸在例如真核细胞等细胞中，并且该方法包括使细胞与融合蛋白接触或在细胞中表达融合蛋白。还提供通过以下方式改进在例如真核细胞等细胞中靶向性脱氨的特异性的方法：在细胞中表达或使细胞与本文所述的包含来自相同亲本脱氨酶的sDA1和sDA2部分的融合蛋白对、以及一种或多种与融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA接触。在一些实施方案中，融合蛋白之一包含nCas9，另一融合蛋白包含ZF或TALE，使ZF或TALE靶向与针对nCas9的gRNA的靶位点邻近的9-24bp序列，其中gRNA与包含所选胞嘧啶的核酸结合。在一些实施方案中，融合蛋白以RNP、mRNA或质粒的形式递送。本文还提供通过以下方式，使核酸中的一个或多个所选胞嘧啶脱氨的方法：使核酸与本文所述的包含来自相同亲本脱氨酶的sDA1和sDA2部分的融合蛋白对、以及一种或多种与融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA接触。此外，本文提供组合物，其包含本文所述的纯化的融合蛋白或融合蛋白对，优选地本文所述的来自相同亲本脱氨酶的sDA1和sDA2部分的融合蛋白对，以及任选地一种或多种与融合蛋白中的Cas9结构域相互作用的gRNA。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种核糖核蛋白(RNP)复合体。本文还提供核糖核蛋白(RNP)复合体，其包含如本文所述的变体spCas9蛋白以及靶向具有PAM序列的序列的指导RNA，所述PAM序列由包含Cas9或Cas9衍生物的分割型脱氨酶融合蛋白靶向。本文还提供使核酸中所选胞嘧啶靶向性脱氨或改进其靶向性脱氨特异性的方法，所述方法包括使核酸与本文所述的一种或多种融合蛋白或碱基编辑系统接触。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含：/n(i)与可编程DNA结合结构域融合的第一分割型脱氨酶部分(sDA1)酶、和任选地一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)序列，所述可编程DNA结合结构域选自由锌指(ZF)、转录激活子效应子样效应子(TALE)、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)Cas RNA指导的核酸酶(RGN)、无催化活性的Cas9(dCas9)、产生切口的Cas9(nCas9)组成的组，其中sDA1是选自由hAID、rAPOBEC1、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、hAPOBEC3H及其变体组成的组的亲本脱氨酶的N端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；或/n(ii)第二分割型脱氨酶部分(sDA2)，其与nCas9、和一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)蛋白、或如用于其互补性sDA1部分的任何正交DNA靶向性结构域融合，其中sDA2是hAID、rAPOBEC1*、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、hAPOBEC3H及其变体的C端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；/n其中(i)的融合蛋白与(ii)的融合蛋白在真核细胞中的共表达以及它们其后在邻近基因组靶位点处的共定位提供具有催化活性的碱基编辑器。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170525 US 62/511,296;20170804 US 62/541,544;20181.一种融合蛋白，其包含：
(i)与可编程DNA结合结构域融合的第一分割型脱氨酶部分(sDA1)酶、和任选地一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)序列，所述可编程DNA结合结构域选自由锌指(ZF)、转录激活子效应子样效应子(TALE)、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)CasRNA指导的核酸酶(RGN)、无催化活性的Cas9(dCas9)、产生切口的Cas9(nCas9)组成的组，其中sDA1是选自由hAID、rAPOBEC1、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、hAPOBEC3H及其变体组成的组的亲本脱氨酶的N端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；或
(ii)第二分割型脱氨酶部分(sDA2)，其与nCas9、和一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)蛋白、或如用于其互补性sDA1部分的任何正交DNA靶向性结构域融合，其中sDA2是hAID、rAPOBEC1*、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G、hAPOBEC3H及其变体的C端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；
其中(i)的融合蛋白与(ii)的融合蛋白在真核细胞中的共表达以及它们其后在邻近基因组靶位点处的共定位提供具有催化活性的碱基编辑器。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白对，其包含：
(i)第一融合蛋白，其包含与一个或多个ZF融合的第一分割型脱氨酶部分(sDA1)酶、和任选地一个或多个UGI序列，其中sDA1是选自由hAID、rAPOBEC1、mAPOBEC3、hAPOBEC3A、hAPOBEC3B、hAPOBEC3C、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G或hAPOBEC3H及其具有改变的底物特异性或活性的变体组成的组的亲本脱氨酶的N端截短、无催化活性或缺陷型衍生物；和
(ii)第二融合蛋白，其包含与nCas9蛋白和一个或多个UGI蛋白融合的第二分割型脱氨酶部分(sDA2)，其中sDA2是与SDA1相同的亲本脱氨酶的C端截短、无催化活性或缺陷型衍生物，
其中(i)的融合蛋白与(ii)的融合蛋白在真核细胞中的共表达以及它们其后在邻近基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·K·乔昂格，J·盎格斯特曼，
申请(专利权)人：通用医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US