一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置制造方法及图纸

一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置，属于免疫学检测技术领域。由储存5倍样品稀释液的容器、储存25倍洗液的容器、储存HNL同源二聚体标准品母液的容器、抗HNL抗体包被的96孔酶标板、储存酶标抗HNL抗体溶液的容器、U型底96孔板、封板膜、储存酶底物溶液的容器及储存终止液的容器组成。酶标板包被抗HNL抗体和酶标抗HNL抗体为同一抗体，从而简单地实现了HNL同源二聚体定量。此外，本装置使用过程中孵育只需两步和清洗只需一步，从而显著缩短了检测时间。因此，本装置具有制备简单、使用方便及测试时间短等优点。本装置可用于以HNL同源二聚体为标志物的疾病(如急性细菌感染)的检测和监控，因此具有巨大的实验室研究和临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本技术属于免疫学检测
，具体涉及一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的快速定量装置。
技术介绍
人中性粒细胞脂质运载蛋白(humanneutrophillipocalin,HNL)也称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，又称脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2)，是一种脂质运载蛋白(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。HNL以单体、同源二聚体及异源二聚体(单体与MMP9分子形成)等多种分子形式存在，不同分子形式HNL与不同的病理过程有关。如单体HNL可能与急性肾损伤有相对较高的相关性(Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125；Lancet2005,365:1231-1238；Biomed.Res.Int.2015,2009,186:48-51；Am.J.Nephrol.2004,24:307-315；中国实用医药2015,24:46-47)，异源二聚体HNL可能与肿瘤侵袭性有关。蔡林君等人研究发现同源二聚体HNL反映尿道感染情况(Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010)；此外，VengePer和XuS.Y.等人研究发现同源二聚体HNL对区分诊断急性细菌感染和病毒感染有很高的特异性和灵敏度(J.Immunol.Methods2015,424:85-90；J.Clin.Lab.Invest.1995，55:125-131)。相对其他分子形式HNL，同源二聚体对诊断急性细菌感染有较高的特异性和灵敏度，可能是因为参与急性细菌感染过程的中性粒细胞分泌的HNL主要是同源二聚体(Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125)。目前已有多种HNL测定方法公开，如RIA(国际专利WO/1995/029404A1和中国ZL200980155194等)、ELISA(欧洲专利EP2225268和中国专利ZL200980155194等)、Western-blotting、胶乳免疫比浊法(中国专利ZL201410431182)、化学发光免疫分析法(中国专利申请号201510184818)、免疫层析试纸条技术(中国专利ZL201220323587、ZL201420423962、ZL201220392399、ZL201220497401、ZL201220323586和ZL201220497401)等。以上各种HNL定量方法有各自优缺点和相应用途，但除Western-blotting能区分不同分子形式HNL外，上述HNL定量方法均不能特异性定量同源二聚体HNL，从而影响该蛋白作为一些疾病如急性细菌感染的诊断能力。虽然，Western-blotting能区分不同分子形式HNL，但是由于该技术本身的缺陷限制了该方法的实际应用。如操作复杂、测试周期长、每次分析样品数量有限以及准确定量困难等。综上，目前实验室研究和将来可能的临床应用急需建立快速、特异性定量同源二聚体HNL的装置及相应方法。
技术实现思路
为了实现人中性粒细胞载脂蛋白HNL同源二聚体分子的特异性定量，本技术设计并开发出了一种基于夹心ELISA技术的HNL同源二聚体的快速定量装置。该装置具有制备方法简单(只需一种抗NHL抗体)、使用快捷(孵育过程只有两步)、检测限低(0.1ng/mL，能满足体液样本中HNL的检出)等优异性能，在急性细菌感染等疾病早期诊断实验室研究和临床检验领域有极大应用潜力。为了实现上述目标，本技术采取如下技术方案：一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)同源二聚体的定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器、储存25倍洗液的容器、储存HNL同源二聚体标准品母液的容器、抗HNL抗体包被的96孔酶标板、储存酶标抗HNL抗体溶液的容器、U型底96孔板、封板膜、储存酶底物溶液的容器及储存终止液的容器组成，所述抗HNL抗体包被的96孔酶标板和酶标抗HNL抗体所使用的抗HNL抗体完全相同；所述抗HNL抗体为单克隆抗体，所述抗HNL单克隆抗体为商品化的抗HNL单克隆抗体(如Abcam公司的ab63929或P&MVengeDiagnosticsDevelopment公司的HNLmab697等)或通过常规方法以HNL单体或HNL同源二聚体免疫动物制备的抗HNL单克隆抗体或基因工程方法制备的抗HNL单克隆抗体，所述抗HNL单克隆抗体所识别的抗原表位在单体HNL上只有一个；所述酶标抗HNL抗体所标记的酶可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。所述定量装置经两步法实现HNL同源二聚体的快速定量，所述两步法是指装置整个使用过程中孵育过程只需两次，所述两次孵育过程第一次是指将酶标抗HNL抗体加入到抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快速加入预先准备的标准品浓度梯度溶液和经稀释后的样品液孵育20～60min，所述两次孵育过程第二次是指第一次孵育后将抗HNL抗体包被的96孔酶标板经洗液工作液清洗后再加入酶底物溶液孵育10～20min后加入终止液；所述预先准备的标准品浓度梯度溶液是指HNL同源二聚体标准品母液经2倍法稀释后制成，所述经稀释后的样品液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本包括尿液、血清、血浆、脑脊液、唾液等。将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得样品稀释液工作液；将25倍洗液用去离子水稀释25倍制成洗液工作液。本技术装置组成、制备及使用方法如下：1)本技术装置组成表1为本技术装置组成，图1和图2为本装置各组成部分的示意图。表1：本技术装置组成序号名称数量1抗HNL抗体包被的96孔酶标板1块25倍样品稀释液1瓶(80mL)3HNL同源二聚体标准品母液1管(300μL)4酶标抗HNL抗体溶液1管(5.5mL)525倍洗液1瓶35mL6酶底物溶液1套7终止液1瓶12mL8常规U型底96孔板1块9封板膜1张2)制备方法a)抗HNL抗体包被的96孔酶标板的制备(1)抗HNL抗体包被96孔酶标板将抗HNL抗体用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释到1～5μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加入100μL抗体包被液，37℃孵育2h或室温孵育4h或4℃过夜。(2)封闭酶标板弃抗体包被液，然后向上述96孔酶标板每孔中加入200～300μL封闭液(封闭液为含2％BSA(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液)；37℃孵育2h或室温孵育4h或4℃过夜。(3)固定酶标板弃封闭液，然后向96孔酶标板每孔中加入200～300μL固定液(固定液为含50％(wt/vol)蔗糖、50％(wt/vol)海藻糖或25％(wt/vol)蔗糖和25％(wt/vol)海藻糖的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3，pH9.6的碳酸钠缓冲液，室温固定30min～2h。(4)密封酶标板弃固定液，室温晾干或25～30℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂放入锡箔纸袋内然后抽真空，4℃保存；通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP‑9定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器(51)、储存25倍洗液的容器(52)、储存HNL/MMP‑9标准品浓度梯度冻干粉的容器(54、55、56、57、58、59、60)、抗MMP‑9抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗HNL抗体溶液的容器(53)或抗HNL抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗MMP‑9抗体溶液的容器(53)、U型底96孔板(30)、封板膜(40)、储存酶底物溶液的容器(61、62)及储存终止液的容器(63)组成，所述HNL/MMP‑9标准品为人源HNL/MMP‑9；所述酶标抗体所标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标准品浓度梯度溶液是指HNL/MMP‑9标准品浓度梯度冻干粉加入200μL样品稀释液工作液制成；所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本为尿液、血清、血浆、脑脊液或唾液；所述样品稀释液工作液是将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得。

【技术特征摘要】
1.一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器(51)、储存25倍洗液的容器(52)、储存HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉的容器(54、55、56、57、58、59、60)、抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗HNL抗体溶液的容器(53)或抗HNL抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗MMP-9抗体溶液的容器(53)、U型底96孔板(30)、封板膜(40)、储存酶底物溶液的容器(61、62)及储存终止液的容器(63)组成，所述HNL/MMP-9标准品为人源HNL/MMP-9；所述酶标抗体所标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标准品浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林君，姜春来，孔维，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：新型
国别省市：吉林;22