一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂组及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂组及其制备方法。本发明专利技术所述的快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂组，包括稀土元素螯合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体(anti-DD)、近红外荧光化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体和系列浓度的D-二聚体校准品。本发明专利技术可同时检测高值和低值D-dimer，尤其是低值D-dimer，且成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用均相荧光免疫检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展，对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
本专利技术属于医学检验领域，具体涉及一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂及其制备方法。
技术介绍
在血凝过程中，纤维蛋白原在凝血酶的作用下，释放出肽A、肽B后，生成纤维蛋白单体(FM)，FM在钙离子及xⅢ因子的作用下，形成交联纤维蛋白，其在纤溶酶的作用下发生降解，降解产物之一就是D-二聚体(D-dimer，DD)。它是交联纤维蛋白的特异性降解产物，血液中D-二聚体升高，说明有纤维蛋白的形成和降解，有继发纤溶的发生。DD的含量变化可以作为体内高凝状态、血栓形成和纤溶亢进的分子标志物之一。DD反映出的特异性并不是指在某一种特定的具体疾病中的表现，而是针对有凝血和纤溶过程的这一大类疾病的共同病理特点。大量研究表明，静脉血栓栓塞病人、肺栓塞病人及深静脉栓塞的病人，体内循环的D-二聚体含量明显增加。D-二聚体在临床检验中应用的十分广泛。研究表明，发生弥漫性内出血(DIC)时，由于广泛的微血栓形成，以及继发性纤溶亢进，导致D-Dimer水平显著增高，其敏感性和特异性显著高于血小板计数、纤维蛋白原定量、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)等筛选检测试验。急性心肌梗死及脑血栓患者急性发病时血浆D-Dimer水平明显增高，D-Dimer检测不仅可作为观察心肌梗死病情的一项指标，而且也是观察溶栓治疗的一种理想检测方法。深静脉血栓(DVT)形成时几乎所有的DVT患者D-Dimer呈阳性，血浆D-Dimer阴性可以基本排除DVT可能。D-Dimer可反映血栓大小的变化，因此可作为溶栓治疗和肝素抗凝的用药指导及疗效观察：治疗期间持续较高，说明治疗无效；含量再升高，预示血栓再发生。继发性纤溶亢进时，D-Dimer水平显著增高，原发性纤溶症时，D-Dimer不增高。陈旧性血栓形成时，D-Dimer不增高。正常妊娠后期的生理性高凝状态下，D-Dimer水平增高，孕妇血浆D—二聚体水平明显高于非孕妇女(p<0.05)，但低于妊高征孕妇(p<0.05)，测定血浆D—二聚体含量对妊高征患者高凝状态的诊断、疗效检测和预后判定有重要意义。组织损伤后对凝血系统的激活可使D-Dimer水平显著增高，另外，除组织损伤可以导致出现血栓形成趋势外，如果患者自身存在遗传性抗凝缺陷，或者存在风险因素的情况下，易发生静脉血栓，导致D-Dimer水平显著增高。目前临床检测D-二聚体的方法有自身红细胞凝集法、乳胶凝集法、酶联免疫吸附法(ELISA)、基于酶免疫法的荧光抗体检测法和免疫金标法。自身红细胞凝集法为半定量方法，其优点是可在全血中检测，省略了离心制备血浆的步骤。乳胶凝集法用于定性或根据其稀释度半定量测定标本中的D-二聚体的含量。酶联免疫吸附法(ELISA)检测D-二聚体不受胆红素、血红蛋白、纤维蛋白原、FDP干扰，因此更精确，敏感性更高。但操作要求严格费时，每次均需同时做标准曲线，不适于单个标本的测定。荧光抗体检测法是目前研究最多的一种检测方法，敏感性很高，与经典ELISA法有很好的一致性，但需要在专用的免疫分析仪上进行，设备成本昂贵。免疫金标法通过肉眼观察或用折射仪读数。与提供的标准色价或者测定标准品的折射读数，可计算出标本中D-二聚体的含量。该法既具有胶乳凝集法的操作简单、快速，适用于急诊测定的优点，不受胆红素，Hb、纤维蛋白原、可溶性的纤维蛋白及FDP等干扰，但对类风湿因子、肝素及脂血等有一定的干扰。均相荧光分析法(homogeneousfluoroimmunoassay,HFIA)是在时间分辨荧光免疫分析(time-resoluedfluoroimmunoassay,TRFIA)技术的基础上形成的一种新的荧光免疫分析技术。TRFIA技术采用的荧光物质与传统的荧光染料完全不同，采用的是镧系元素铕(Eu)、锝(Tb)等作为荧光材料，灵敏度非常高，稳定性好，低温条件可保存三年，因而成为二十一世纪最热门的免疫分析技术。均相荧光免疫检测法是用同一抗原的两个抗体分别标记Eu3+和荧光染料Alexa647。Eu3+标记抗体在游离状态时，受到340nm光线激发，只发射平均波长为615nm荧光，而在抗原、抗体复合物形成时，发生能量传递，激发荧光染料Alexa647发射出665nm荧光。标记抗体直接与待测样品进行抗原、抗体反应，如果能形成抗原、抗体复合物，则在665nm出可测得荧光信号。这种方法省却了酶联免疫法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。并且，此法也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。此外，Eu3+和Alexa647这对荧光物质的最大发射光波长之间相差较大，未发生抗原抗体反应的本底荧光值就非常低。而人血清中非特异性物质产生的300～500nm荧光，不能激发Alexa647发射荧光信号650nm激发光。因此非特异性荧光非常低。本专利技术采用均相荧光免疫快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，同样也避免了胶体金或者荧光D-Dimer干式免疫试纸中的硝酸纤维素膜本身孔隙不均一特性对检测准确度和重复性的不良影响。由于均相荧光免疫检测中样品与荧光标记抗体全过程都在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高检测灵敏度和线性范围，同时反应在液相进行也增加了样品的稀释倍数，消除了样品的基质效应影响，使定量结果有很好的可重复性，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足临床诊断大规模检测的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有D-Dimer检测技术的不足，提供一种快速定量检测D-Dimer的均相荧光免疫试剂组。本专利技术根据荧光免疫技术特点和D-Dimer抗原抗体系统特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本专利技术提供的试剂组检测D-Dimer水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。本专利技术的第一个方面是提供一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂组，包括稀土元素螯合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体(anti-DD)、近红外荧光化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体和系列浓度的D-二聚体校准品。优选地，稀土元素螯合物为Eu3+螯合物。更优选地，稀土元素螯合物为BHHCT-Eu3+或1,2-二(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯与铕(Ⅲ)的配合物(BHHBCB-Eu3+)。优选地，所述近红外荧光化合物为Alexa系列近红外荧光化合物、DyLight系列近红外荧光化合物和CF系列近红外荧光化合物中的至少一种。更优选地，所述近红外荧光化合物Alexa647、DyLight-DY647和CF647中的至少一种。优选地，所述系列浓度的D-二聚体校准品由校准品稀释液稀释D-二聚体配制而成，所述校准品稀释液为含0.01-0.5wt％PEG800、1-5wt％BSA、5-20wt％甘油、0.01-0.05wt％表面活性剂的Tris缓冲液。D-二聚体校准品可用塑料瓶密封包装。本专利技术的第二个方面是提供本专利技术第一个方面所述的均相荧光免疫试剂组的制备方法，包括以下步骤：1)稀土元素螯合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速定量检测D‑二聚体的均相荧光免疫试剂组，其特征在于，包括稀土元素螯合物标记的抗D‑二聚体单克隆抗体、近红外荧光化合物标记的抗D‑二聚体单克隆抗体和系列浓度的D‑二聚体校准品。

【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测D-二聚体的均相荧光免疫试剂组，其特征在于，包括稀土元素螯合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体、荧光化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体和系列浓度的D-二聚体校准品，稀土元素螯合物为BHHCT-Eu3+或BHHBCB-Eu3+，荧光化合物AlexaFluor647、DyLight-DY647和CF647中的至少一种，且所述试剂组的制备方法包括以下步骤：1)稀土元素螯合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体的制备：取0.5-5mg/ml的抗D-二聚体单克隆抗体溶液，加入0.05-0.5mol/L的NaHCO3溶液后，调pH至8.5-10，滴加10-100μg/ml配体化合物溶液，搅拌反应0.6-2h，分离得到配体化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体，加入终浓度为0.05-0.5wt％的BSA和0.01-1wt％的NaN3，调pH至5.5-6.5，免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配体化合物与Eu3+等摩尔浓度，即得，其中，抗D-二聚体单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢爱武，
申请(专利权)人：深圳市艾瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44