本发明专利技术公开了一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，属于分析检测领域。该方法采用BSA作为包被抗原及标准品，筛选高特异性、高纯度的抗BSA单克隆抗体作为一抗，羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体为二抗，四甲基联苯胺(TMB)为底物，建立敏感、特异的间接竞争ELISA，并用数学方法对结果进行分析。该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于过敏原BSA的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白。
技术介绍
食物过敏是一种人体对食物中抗原物质产生的由免疫介导的不良反应，由此引发身体产生一系列临床病理生理的变化，严重时可能产生过敏性休克，甚至危及生命。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界约25％的人患有过敏性疾病，并且以每10年23倍的速度增加，在我国就有2亿多食物过敏原患者。近年来，随着工业化、城镇化、全球化进程不断加快，人们生活节奏、方式不断改变，生活压力不断加剧，以及食物种类、加工工艺越来越多，许多原来不过敏的人群逐渐演变成过敏性体质，潜在过敏人群不断扩大；同时，随着科技、医疗水平的提高，许多原来未认识到的过敏现象被不断揭示出来。食物过敏已成为全世界关注的公共卫生热点问题，而且这个问题正呈现出逐渐扩大的趋势。过敏性疾病属于慢性病，所产生的直接或间接费用对过敏患者及其家庭，对卫生系统和全社会有严重的影响。据报道约90％的食物过敏反应主要是由常见的八类食物过敏原(大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、蛋类、鱼类和甲壳纲动物)引起。其中，牛奶是一类非常重要的过敏原，在儿童中发病率约为0.3％～7.5％，在成年人中的发病率则小于1％。牛奶过敏引起的症状表现在呼吸道、消化道和皮肤过敏等，也有可能成为其他过敏性疾病的诱因。因此，牛奶过敏问题日益受到国内外学者的关注和研究。牛奶中引起过敏反应的蛋白包括：β-乳球蛋白(β-LG)、酪蛋白(CAS)、α-乳白蛋白(α-LA)、牛血清白蛋白(BSA)、乳铁蛋白(LF)以及免疫球蛋白(Igs)等。其中BSA的致敏性较为常见，美国约有50％牛乳过敏患者对BSA产生过敏，且其引发的过敏反应不受其它过敏原的影响。现还证实引起牛肉过敏的主要过敏原就是存在于血浆中的BSA。此外，BSA在医学临床及生物领域也有着广泛的应用，这使得过敏患者很难避免接触过敏原BSA而遭受健康威胁。迄今为止，针对食物过敏尚无有效的治疗方法，在食品标签上标识过敏原的存在是避免过敏患者食入潜在过敏原的最有效的途径。因此，为保证过敏原标签、标识制度的实施，各国研究者纷纷开展了针对食物过敏原检测方法的研究。但目前针对过敏原BSA的检测方法报道较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述存在的问题提供一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，该方法包括以下步骤：第一步，抗体的制备，具体的制备过程如下：(1)动物免疫：选取雌性小鼠，将抗原BSA与弗氏完全佐剂混合首次皮下注射进行免疫，2～3周加强免疫1次，根据小鼠血清效价ELISA检测结果，选取效价在1：10000以上的小鼠脾细胞进行细胞融合；(2)细胞融合：将骨髓瘤细胞和经BSA免疫后小鼠的脾细胞混合，通过PEG促使细胞融合；融合10d后开始进行筛选检测；(3)融合筛选及亚克隆：将融合后的细胞采用ELISA进行检测，选取ELISA结果判断为阳性的细胞；根据有限稀释法将该阳性的细胞进行亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，获得1株稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G6；(4)腹水制备及纯化：向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞株9G6，7～10d后取腹水，将所收集的腹水离心取上清液，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水上清液用PBS缓冲液稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用PBS缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；第二步，标准曲线的绘制，具体过程如下：①抗原包被：将抗原稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；③竞争结合：用封闭液将抗原稀释为460ng/mL，然后做2倍梯度稀释，共计23个浓度梯度，按每孔50μL将各梯度的稀释液加入孔内；随即每孔加入50μL稀释过的纯化后的抗体，与之前加入的不同浓度梯度的抗原标准溶液混合，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；⑥标准曲线绘制：以抗原浓度的对数为横坐标，各浓度孔的OD450值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算半数效应浓度；⑦线性范围确定：根据标准曲线呈明显相关的区段，以标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率[(A标/A0)×100％]为纵坐标绘制拟合后的标准曲线，其中A0为零标准品孔OD450值，A标为各浓度标准品孔OD450值；第三步，将待测样品采用如下测定程序进行测定：①抗原包被：用包被缓冲液将待测样品稀释至工作浓度，加入酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；③竞争结合：先将待测样品加入酶标板，每孔50μL，再加入纯化后的抗体，每孔50μL，室温竞争反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；⑥采用第二步拟合的标准曲线，计算得到待测样品的浓度。本专利技术技术方案的第二步①中，抗原包被浓度为0.25μg/mL。本专利技术技术方案的第二步③中，抗体稀释终浓度为1:32000。本专利技术技术方案的第三步①中，工作浓度为0.25μg/mL。附图说明图1单克隆抗体SDS-PAGE电泳图；图2单克隆抗体免疫分析结果；图3包被抗原工作浓度和抗体稀释倍数对反应灵敏度的影响；图4标准曲线；图5线性拟合曲线；图6特异性检测。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于此：细胞及实验动物鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自中国科学研究院上海细胞研究所。6～8周龄BALB/c雌性小鼠购自中国科学院上海实验动物中心。主要试剂牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司；蛋白定量试剂盒(BCAProteinAssaykit)，美国Novagen公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、四甲基联苯胺(TMB)显色液，购自美国Promega公司；羊抗鼠IgG辣根过氧化物(HRP)标记抗体购自美国Proteintech公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Miliipore公司。主要设备各种量程微量移液器，德国Eppendorf公司；酶标仪(iMark)、凝胶成像仪(GelDocXR)，美国Bio-Rad公司；CO2恒温培养箱(MCO-15AC)，日本SANYO公司；台式高速冷冻离心机(Allegra64R)，美国Beckman公司；紫外可见分光光度计(Spect本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，其特征在于：该方法包括以下步骤：第一步，抗体的制备，具体的制备过程如下：(1)动物免疫：选取雌性小鼠，将抗原BSA与弗氏完全佐剂混合首次皮下注射进行免疫，2～3周加强免疫1次，根据小鼠血清效价ELISA检测结果，选取效价在1：10000以上的小鼠脾细胞进行细胞融合；(2)细胞融合：将骨髓瘤细胞和经BSA免疫后小鼠的脾细胞混合，通过PEG促使细胞融合，融合10d后开始进行筛选检测；(3)融合筛选及亚克隆：将融合后的细胞采用ELISA进行检测，选取ELISA结果判断为阳性的细胞；根据有限稀释法将该阳性的细胞进行亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，获得1株稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G6；(4)腹水制备及纯化：向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞株9G6，7～10d后取腹水，将所收集的腹水离心取上清液，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水上清液用PBS缓冲液稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用PBS缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；第二步，标准曲线的绘制，具体过程如下：①抗原包被：将抗原稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；③竞争结合：用封闭液将抗原稀释为460ng/mL，然后做2倍梯度稀释，共计23个浓度梯度，按每孔50μL将各梯度的稀释液加入孔内；随即每孔加入50μL稀释过的纯化后的抗体，与之前加入的不同浓度梯度的抗原标准溶液混合，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；⑥标准曲线绘制：以抗原浓度的对数为横坐标，各浓度孔的OD450值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算半数效应浓度；⑦线性范围确定：根据标准曲线呈明显相关的区段，以标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率[(A标/A0)×100％]为纵坐标绘制标准曲线，其中A0为零标准品孔OD450值，A标为各浓度标准品孔OD450值；第三步，将待测样品采用如下测定程序进行测定：①抗原包被：用包被缓冲液将待测样品稀释至工作浓度，加入酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；③竞争结合：先将待测样品加入酶标板，每孔50μL，再加入纯化后的抗体，每孔50μL，室温竞争反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；⑤显色：加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光显色30min，加终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定OD450值；⑥采用第二步线性范围确定后标准曲线，计算得到待测样品的浓度。...
【技术特征摘要】
1.一种采用间接竞争ELISA法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白，其特征在于：该方法包括以下步骤：第一步，抗体的制备，具体的制备过程如下：(1)动物免疫：选取雌性小鼠，将抗原BSA与弗氏完全佐剂混合首次皮下注射进行免疫，2～3周加强免疫1次，根据小鼠血清效价ELISA检测结果，选取效价在1：10000以上的小鼠脾细胞进行细胞融合；(2)细胞融合：将骨髓瘤细胞和经BSA免疫后小鼠的脾细胞混合，通过PEG促使细胞融合，融合10d后开始进行筛选检测；(3)融合筛选及亚克隆：将融合后的细胞采用ELISA进行检测，选取ELISA结果判断为阳性的细胞；根据有限稀释法将该阳性的细胞进行亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，获得1株稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G6；(4)腹水制备及纯化：向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞株9G6，7～10d后取腹水，将所收集的腹水离心取上清液，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水上清液用PBS缓冲液稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用PBS缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体；第二步，标准曲线的绘制，具体过程如下：①抗原包被：将抗原稀释，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h，弃包被液，用PBST洗涤5次，拍干；②封闭：按每孔200μL加入封闭液，室温封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤5次，拍干；③竞争结合：用封闭液将抗原稀释为460ng/mL，然后做2倍梯度稀释，共计23个浓度梯度，按每孔50μL将各梯度的稀释液加入孔内；随即每孔加入50μL稀释过的纯化后的抗体，与之前加入的不同浓度梯度的抗原标准溶液混合，室温反应2h，弃溶液，用PBST洗涤5次，拍干；④加酶标二抗：加入羊抗鼠IgG辣根过氧化物标记抗体，每孔100μL，室温反应1h，弃溶液，用P...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，朱业培，吕青骎，徐幸莲，周光宏，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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