本发明专利技术涉及携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的VP60蛋白重组杆状病毒及其应用，属于生物技术领域。通过PCR扩增兔出血症病毒衣壳蛋白VP60（无起始密码子）基因，将PCR扩增产物克隆入pMD19-T载体后连接入真核转移载体，插入口蹄疫病毒B细胞表位(200～213aa）构建重组杆状病毒载体，转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒。本发明专利技术可以提供一种携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白重组杆状病毒及携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样粒子（嵌合蛋白），以此嵌合蛋白作为抗原免疫小鼠，可诱导产生抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白阳性抗体，因此，此嵌合蛋白可作为预防控制O型口蹄疫疫苗的抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白VP60重组杆状病毒及其应用，属于生物
技术介绍
病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)由多拷贝的一种或几种病毒结构蛋白聚合而成，多为杆状或二十面体，直径大约在25 IOOnm之间，其结构和抗原性均与活病毒颗粒保持相同。VLPs由一种或几种结构蛋白多聚而成，因此，其表面抗原以一种有序和重复的方式被展示，这种展示可快速显著地诱导高水平的免疫应答。另外，VLPs大小适中，可有效被树突状细胞等抗原递呈细胞识别捕获，从而诱导更有效的免疫应答。VLPs易纯化，可通过密度梯度离心或尺寸色谱法纯化。基于这些优点，VLPs已成为疫苗研究的热点。兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)是由兔出血症病毒(RHDV)引起的兔的传染性疾病，病程短、死亡率高，是家兔烈性传染病。VP60蛋白是RHDV主要的结构蛋白，在动物体内可诱导产生中和抗体，是病毒免疫保护性抗原。研究发现在没有其他任何成分存在的条件下，VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV粒子在物理形态上类似的VLPs。这种VLPs具有很好的免疫原性，本身就可作为免疫佐剂，可以以胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞，分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。研究表明，这种病毒样颗粒可嵌合表达外源基因并作为疫苗载体，这就使RHDV VP60作为其他动物疾病甚至人类疾病的 VLPs疫苗载体成为可能。口蹄疫(foot-and-mouth disease virus,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、 羊、猪等家畜急性、热性、高度接触性传染病。由于其传播快，不仅给畜牧业造成了巨大的经济损失，而且严重影响国际贸易，世界动物卫生组织将其列为必须上报的疫病之一。FMD血清型众多，包括0、A、C、Asial、SATl、SAT2和SAT 3型共7个血清型，血清型间无交叉保护，控制难度较大。2003年欧盟修订了 FMD防控策略，肯定了疫苗免疫在FMD爆发时的作用， 随后欧盟多个国家将疫苗免疫作为补充手段用于FMD的控制。灭活疫苗在欧美等地的FMD 防制和根除中发挥了重要的作用，直到今天，灭活疫苗仍然是成功防控FMD的重要措施。但也有不足之处对于有效的免疫，疫苗的抗原含量要保证，生物安全防护级别较高，灭活不完全可能导致散毒，疫苗存在病毒毒力返强等，另外，灭活疫苗的生产成本较高。加快安全有效的新型口蹄疫疫苗开发研究，对于成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫是十分必要的。 随着生物技术的发展，基因工程疫苗是未来的发展方向，并已经取得了一定的成果。研究表明，O型FMDV VPl至少有5个B细胞表位，其中最重要的一个表位由VPl的141 160位 (G-H环)和C端200 213位氨基酸残基线性表位组成，为最重要的B细胞表位，也是FMDV 最重要的抗原位点。复旦大学、上海畜牧兽医研究所的科研人员专利技术了一种家畜口蹄疫病毒多肽疫苗。该多肽疫苗是用化学方法合成编码VPl蛋白中有免疫原性的141 160位氨基酸和200 213位氨基酸的小肽基团，将其串联，再插入质粒载体大分子上转入细菌表达，经过发酵即得抗口蹄疫病毒疫苗，在我国口蹄疫的预防中起到重要的作用。我们课题组在RHDV衣壳蛋白VP60基因的不同位置分别插入单个外源B细胞表位(FMDV VPl B细胞表位 200 213aa)和双串联 B 细胞表位(FMDV VPl (141 160aa)_GS_ (200 213aa))，构建6种重组转移载体并在Sf9细胞中进行表达，通过电镜观察和动物实验，研究加入这些外源片段对VLPs的组装及外源片段的免疫原性，结果发现，与其他插入位点相比，在RHDV衣壳蛋白VP60基因的N-端插入单个外源B细胞表位(FMDV VPl B细胞表位200 213aa)， 重组病毒表达的嵌合蛋白可形成VLPs,表明衣壳蛋白VP60本身具有疫苗载体性质,可以在不改变结构的情况下携带外源片段；嵌合蛋白具有与VP60蛋白相同的对人“O”红细胞凝集特性，易于疫苗抗原的定量与检测；动物实验显示嵌合蛋白在小鼠体内能诱导产生抗O型口蹄疫病毒VPl蛋白阳性抗体。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是通过分子生物学技术构建重组杆状病毒载体，提供一种免疫效果好、工艺简便的携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白VP60重组杆状病毒及病毒样粒子疫苗的制备方法。技术方案携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白VP60重组杆状病毒，是由以下方法构建而成的以质粒pFastBac l-VP60为模板，PCR扩增出兔出血症病毒衣壳蛋白 VP60基因片段，将其克隆入转移载体，再将口蹄疫病毒FMDV VPl B细胞表位200 213aa 插入转移载体中VP60基因片段的合适位置，然后将重组质粒转化含有穿梭载体Bacmid的 E. coli DHlOBac感受态细胞，转染Sf9细胞，获得携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白VP60重组杆状病毒rAcV-Bac-NF。用所述重组杆状病毒rAcV-Bac-NF制备的携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样粒子嵌合蛋白。其方法为将权利要求I所述重组杆状病毒接种于Sf9细胞，收获细胞培养物，即为携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样粒子嵌合蛋白。所述重组杆状病毒rAcV-Bac-NF或携带O型口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样粒子嵌合蛋白在制备预防、诊断或治疗口蹄疫药物中得到应用。用所述重组杆状病毒rAcV-Bac-NF制备的携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白病毒样粒子疫苗，其制备方法为培养Sf9细胞至对数生长期，接种权利要求 I所述重组杆状病毒，等细胞有病变后5天收毒，用PH 7. 4灭菌磷酸盐缓冲溶液PBS重悬， 按抗原弗氏佐剂体积1:1比例加入佐剂，混匀，即为携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒衣壳蛋白病毒样粒子疫苗。O型口蹄疫病毒B细胞表位插入兔出血症病毒衣壳蛋白VP60中，未改变衣壳蛋白 VP60的生物活性，即红细胞凝集特性，嵌合蛋白同样具有红细胞凝集特性，可用红细胞凝集试验(HA)进行抗原血凝效价测定。有益效果本专利技术的特点和优点如下本专利技术选取兔出血症病毒衣壳蛋白VP60 作为展示外源口蹄疫病毒B细胞表位的载体，原因是用杆状病毒系统表达VP60蛋白，重组蛋白在没有其他任何成分存在的条件下，在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),该VLPs是由 180个结构相同的亚单位组成，每个亚单位均展示外源口蹄疫病毒B细胞表位，与其他展示系统不同，一个病毒样粒子可以展示180个口蹄疫病毒B细胞表位，无形中增加了抗原有效成分的拷贝数，有利于疫苗免疫效力的提高，同时VP60本身还可作为免疫佐剂；该VLPs缺乏遗传信息而失去复制能力，同时重组杆状病毒仅感染非脊椎动物，不感染人类及其他动物。因此，与传统口蹄疫疫苗相比，利用此系统表达的病毒样粒子制备疫苗具有很好的生物安全性。真核表达系统具有类似于哺乳动物细胞的翻译后修饰功能，使重组衣本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，盛蓉，范志宇，胡波，魏后军，薛家兵，姜平，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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