一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法技术

本发明专利技术涉及一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，该方法包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，该方法包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。【专利说明】
本专利技术涉及，其属于超薄切片制样领域。
技术介绍
透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM)技术是检测和研究病毒的重要手段，也是未知病原诊断和生物恐怖袭击病原鉴定的首选技术之一(参考文献 1，2)。TEM技术在乙型肝炎病毒、轮状病毒、汉坦病毒、SARS-Cov等许多病毒的发现和鉴定过程中发挥过重要作用(参考文献3-6)。负染技术和超薄切片技术是组成生物TEM技术体系的重要技术。液体标本主要通过负染技术进行检测，组织和培养细胞等固体标本主要通过超薄切片技术进行检测。通常情况下，培养的贴壁细胞的超薄切片制样过程需要以下步骤完成:首先通过胰酶消化使细胞脱离培养界面或直接用细胞刮子刮脱细胞，再将脱壁的细胞进行离心使细胞聚集成团块，继而对细胞团块进行醛类和锇酸双固定、梯度乙醇(或环氧丙烷或丙酮)脱水、树脂浸润、包埋、聚合、修块、和切片等处理程序。上述方法仍然是感染病毒细胞透射电镜检测的主要手段。上述传统方法有如下几个不足之处:(1)由于通过离心使细胞沉淀而形成团块，使得所观察的细胞是随机的，往往需要花费较长时间和精力寻找目标细胞，从而降低了检测效率。(2)在细胞的收获过程中由于对细胞进行酶消化或刮取等操作，对细胞造成了不可避免的人工损伤，从而改变了细胞的自然状态，包括细胞的形状、细胞器的功能形态及细胞超微结构的改变等；(3)当病变细胞的数量比例较小时，电镜检测到目标细胞的几率也较小， 所以一般会采用延长培养时间，以使病变细胞数量增多，从而增加超薄切片检测的几率，但是这就会延长电镜检测的周期；(4)与贴壁细胞原位处理相比，细胞团块体积大，固定、脱水、浸润等步骤需要较长的时间。比如对细胞团块进行固定一般需要I小时，而单层细胞固定仅需5-10分钟即可。细胞团块进行脱水需要至少I小时，而贴壁细胞仅需10分钟。对细胞团块进行浸润、洗涤等步骤的时间也远长于贴壁细胞。为了实现针对目标细胞进行超薄切片，洪涛等建立了钉扣包埋方法(参考文献 7，8)，以实现对贴壁培养细胞中的目标细胞进行定位取样与超薄切片操作，但该方法对细胞进行钉扣的技术要求高，操作繁琐。为实现针对目标细胞的超薄切片操作，本研究对感染细胞通过修块以直接暴露目标细胞，再进行垂直于目标细胞平面的超薄切片；或用空芯钻头钻取目标细胞，再针对目标细胞进行平行于目标细胞平面的超薄切片，通过上述两种方法实现对目标细胞的定位超薄切片，提高超薄切片电镜检测病变细胞的效率。Hazelton P R, Gelderblom H R.Electron microscopy for rapid diagnosis of infectious agents in emergent situations.Emerg Infect Dis, 2003，9(3):294-303.Biel S S, Gelderblom H R.Diagnostic electron microscopy is still a timely and rewarding method.J Clin Virol, 1999, 13(1-2):105-19.Dane D S，Cameron C H，Briggs M.Virus-like particles in serum of patients with Australia—antigen-associated hepatitis.Lancet, 1970，1:695 - 698.Bishop R F, Davidson G P，Holmes I H，et al.Virus particles in epithelial cells of duodenal mucosa from children with acute nonbacterial gastroenteritis.Lancet, 1973，2:1281 - 1283.Hung T，Xia S M，Zhao T X，et al.Morphological evidence for identifying the viruses of hemorrhagic fever with renal syndrome as candidate members of the Bunyaviridae family.Arch Virol, 1983, 78(1-2):137-144.Drosten C，Gunther S, Preiser W, et al.1dentification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.New Engl J Med, 2003，348:967 - 976.洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京科学出版社，1984，洪涛，方肇寅，周静仪，等.电子显微镜观察病毒感染细胞包埋技术的改进.微生物学报，1973，13:44-50
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的是解决现有细胞样本超薄切片技术中存在的目标细胞分布随机、定位不准确、检测效率低的问题，提供。所述方法能准确暴露目标细胞，并对其进行定位超薄切片，以提高超薄切片的电镜检测效率。用于解决问题的方案本专利技术提供了。该方法包括以下步骤:(1)以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，(2)通过修块直接暴露目标细胞,或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，(3)针对目标细胞进行超薄切片，(4)采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。本专利技术所述的方法，其中所述步骤(2)中的修块暴露为通过刀片将目标细胞周围的细胞及树脂切除。本专利技术所述的方法，其中所述步骤(2)中的钻取目标细胞为通过空芯钻头钻取树脂块上的目标细胞。本专利技术所述的方法，其中所述步骤(3)中的目标细胞的超薄切片操作为垂直于处理细胞平面进行超薄切片。本专利技术所述的方法，其中所述步骤(3)中的目标细胞的超薄切片操作为平行于处理细胞平面进行超薄切片。本专利技术所述的方法，其中所述方法包括将切片位置定位在目标细胞部位。本专利技术所述的方法，其中所述病毒为人腺病毒或流感病毒。本专利技术所述的方法，其中所述方法包括对目标细胞进行固定、脱水、浸润、包埋和超薄切片。本专利技术所述的方法，其中所述目标细胞的固定、脱水、浸润、和包埋过程均在原位 进行。本专利技术所述的方法，其中所述超薄切片厚度为70_100nm。专利技术的效果本专利技术通过定位超薄切片技术成功对目标病变细胞进行超薄切片，可以在目标细 胞的切片上容易地观察到病毒颗粒。本专利技术提供一种针对目标细胞的定位超薄切片方法， 该方法具有准确定位、快速检测病变细胞的能力，从而提高电镜检测效率。本专利技术的病变细胞定位超薄切片法与传统超薄切片法相比具有以下优点:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋敬东，屈建国，洪涛，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：