本发明专利技术属于生物技术领域，公开了艰难梭菌外毒素A检测试剂盒及组成该试剂盒的单克隆抗体。一种检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒，包含两种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，分别为保藏号为CGMCC?No.4979的杂交瘤细胞产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的由保藏号为CGMCC?No.4980的杂交瘤细胞系产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体。本发明专利技术提供的艰难梭菌外毒素检测试剂盒，通过使用两株高亲和力的配对单抗，使检测艰难梭菌的灵敏度有了显著提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及艰难梭菌外毒素A检测试剂盒及组成该试剂盒的单克隆抗体。
技术介绍
艰难梭菌是一种革兰氏染色阳性、有芽胞、专性厌氧的梭状杆菌。当前，艰难梭菌感染的预防、诊断、治疗面临着重重困难。一方面，艰难梭菌广泛存在于院内环境中，而且作为其休眠形式的芽胞能够耐受多种院内常用的消毒剂，它已经成为仅次于弯曲杆菌的院内感染性腹泻的主要病原体；甲硝唑、万古霉素，作为治疗艰难梭菌感染的两种主要的药物， 它们的耐药性也在不断地累积、传播，疗效日趋降低，而且对于复发病例的治疗，这两种药物呈现出无能状态。另外一方面，到目前为止，尚无有效的、商品化的疫苗问世；基于毒素的 ELISA检测试剂盒价格昂贵，难以对艰难梭菌进行临床常规检测，也不适用于大规模的流行病学调查和长期监测；治疗性抗体作为一种安全、有效、廉价的抗生素替代品，前景光明却依然处于探索期。所以，急需开发安全、有效、方便、廉价的艰难梭菌疫苗来保护高危人群， 在疫苗的基础上开发相应的单克隆抗体，为诊断试剂及治疗性抗体提供可能。艰难梭菌通过粪口途径进入消化道，继而分泌外毒素而导致腹泻。毒素A既是一种肠毒素，又是一种细胞毒素，是艰难梭菌致病的主要毒力因子之一。研究发现，艰难梭菌外毒素A只有当其羧基端与靶细胞表面受体结合后才能够发挥毒性作用；艰难梭菌外毒素 A的分子表面结构大部分为其羧基端所覆盖；针对艰难梭菌外毒素A羧基端的抗体，能有效抑制其肠毒性和细胞毒性，具有保护效应。所以，艰难梭菌外毒素A羧基端是疫苗研究和抗体开发的理想结构域。DNA免疫是近年发展起来的一种新型抗体制备法。DNA免疫克服了传统蛋白质免疫方法的缺陷，能更为有效地激活机体的体液和细胞免疫应答。首先是在仅知DNA编码而不能获得目的蛋白，或获得的蛋白为低免疫性的情况下，通过DNA免疫可产生高效价特异性的抗体，这为单抗制备提供了一种简单易行的方法。同时DNA免疫因为存在体内抗原表达和递呈的过程，所以它最接近活细菌感染机体免疫反应过程并且很完整保存了抗原构象，由此产生的抗体对构想表位有更好的特异性，因此增加了得到具有中和抗体活性单抗的可能性。DNA免疫制备单抗为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒。本专利技术的另一目的是提供组成该试剂盒的两株单克隆抗体。本专利技术的又一目的是提供所述两株单克隆抗体的应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现一种检测艰难梭菌外毒素A的试剂盒，包含两种识别不同表位的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，分别为保藏号为CGMCC No. 4979的杂交瘤细胞产生的抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体以及保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体。所述的辣根过氧化物酶标记的由保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体的稀释度为I : 2000。分泌抗艰难梭菌外毒素A羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No. 4979，保藏日期为2011年6月23日。一种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No. 4979的杂交瘤细胞系产生。所述的单克隆抗体在制备艰难梭菌外毒素的诊断试剂中的应用。所述的单克隆抗体在制备治疗艰难梭菌外毒素感染的药物中的应用。分泌抗艰难梭菌外毒素A羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No. 4980，保藏日期为2011年6月23日。一种抗艰难梭菌外毒素A羧基端抗原的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No. 4980的杂交瘤细胞系产生。所述的单克隆抗体在制备艰难梭菌外毒素的诊断试剂中的应用。所述的单克隆抗体在制备治疗艰难梭菌外毒素感染的药物中的应用。本专利技术的有益效果I、目前，国内尚无合适的检测艰难梭菌感染的诊断试剂盒，而国际上已研发成功的试剂盒价格昂贵，这也阻碍了国内艰难梭菌诊断的发展，本专利技术提供的艰难梭菌外毒素检测试剂盒，通过使用两株高亲和力的配对单抗，使检测艰难梭菌的灵敏度达到了国际标准。这一试诊断试剂盒的开发可极大的促使国内开展广泛艰难梭菌的研究，同时也可以对艰难梭菌感染进行大规模的流行病学调查和长期的监测。2、本专利技术以选取艰难梭菌外毒素A基因羧基端末尾978个碱基序列为研究模板，对该序列进行密码子优化处理，设计得到TcdA-C基因序列，并将该优化后的序列装入 PJW4303载体中，构建一密码子优化的TcdA-C基因的DNA疫苗。用该DNA疫苗通过电穿孔免疫小鼠，经过常规细胞融合、筛选及单克隆化，建立稳定分泌抗TcdA-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用捕获ELISA方法进行筛选，杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性识别商品化toxinA及艰难梭菌分泌的外毒素A。捕获ELISA较之直接包被ELISA方法主要有几方面的优势a.抗原以自然状态与特异性抗体结合；b.敏感性高；c.检测信号的强弱较大程度上依赖于抗体的捕获能力，换言之，这种方法能筛选出试剂盒所需的具有高亲和力的抗体。通过捕获法筛选获得的2株高亲和力的单抗进行配对，其对抗原的检测灵敏度达到国际市场上应用最广的3家艰难梭菌检测试剂盒的灵敏度，这对艰难梭菌感染的诊断，治疗及疫苗制备等具有重要意义。3、虽然新近已有针对外毒素A羧基端的治疗性单克隆抗体问世，但仍处在早期临床试验阶段，所呈现的治疗效果也有一定的局限性。我们制备多株高亲和力的单抗在CHO 细胞上的被动保护试验呈现保护作用，通过人源化后可用于开发安全、有效、廉价的治疗性抗体。生物材料保藏信息I、杂交瘤细胞株5D8D5，分类命名为杂交瘤细胞株SP2/0，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 4979，保藏日期为2011年6月23日。2、杂交瘤细胞株2C7B6，分类命名为杂交瘤细胞株SP2/0，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 4980，保藏日期为2011年6月23日。附图说明图I单抗在细胞水平的中和保护试验结果照片。A为空白细胞对照，B为未加单抗仅加毒素的细胞对照，C为15ug/ml 2C7B6与毒素共同作用，D为15ug/ml 5D8D5与毒素共同作用。具体实施例方式实施例L DNA疫苗pJW4303-TcdA_C的构建详见申请号为2010101309048的中国专利技术专利申请说明书实施例I 4。实施例2. 293F细胞转染293F 细胞(购自 invitrogen 公司，cat No. R790-07)用含 293F 细胞培养基 37°C， 5% CO2饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，转染前一天接种细胞6 7xl05cells/ml,转染当天,取少量细胞计数,细胞数约为 lxl06cells/ml,准备 Iipid-DNA 复合物。a.用 opti-MEM I 稀释 30ug pJW4303-TcdA_C 质粒至 1ml,轻轻混勻。b.用opti-MEM I稀释60ul 293fectin至1ml,本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春华，王世霞，金柯，黄祖瑚，卢山，
申请(专利权)人：张春华，王世霞，金柯，黄祖瑚，卢山，
类型：发明
国别省市：
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