本发明专利技术公开了一种分离纯化普那霉素的方法，属于生物技术领域。该方法的主要步骤为：吸附树脂洗脱、纳滤浓缩、溶媒结晶、浓缩干燥后获得普那霉素成品，经检测其纯度达到98％以上，产品收率高于68％。本发明专利技术采用上述分离纯化获得普那霉素，能耗低，设备结构简洁紧凑，方法易行，操作安全方便，易于实现自动化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别是涉及到。
技术介绍
近年来，临床上分离的病原菌的种类及药敏类型均发生了很大的变化，MRSA、VRE、 PPSP等耐药菌引起的严重感染使可选用药物相对减少，故很有必要寻找新的有效的治疗药物。普那霉素又名原始霉素，是由始旋链霉菌(Sti^ptomyces pristinaespiralis)产生的一类能抗多重耐药菌的链阳性菌素类抗生素，其由两类化学性质不同的物质组成，分别是属于B族链阳性菌素的普那霉素I (PIA、PIB、PIC)和属于A族链阳性菌素的普那霉素 II(PIIA、PIIB)，二者组合比例大约是30%的普那霉素I和70%的普那霉素II。1、普那霉素的功能及应用(1)抗菌活性试验表明普那霉素在体内、外对众多革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌及厌氧菌都具有较强的杀菌作用，对甲氧西林、红霉素耐药或敏感的金葡球菌、溶血葡球菌、表葡球菌、肺炎链球菌等皆具有很强的抗菌活性。体外试验表明，普那霉素与万古霉素存在协同作用，且体内试验显示普那霉素对红霉素耐药或敏感的MRSA的疗效同万古霉素相当。此外， 普那霉素还可有效预防红霉素耐药或敏感的链球菌引起的心膜炎。另外，普那霉素具有较长的抗生素后效应。Videau等通过小鼠的体内、体外试验发现，在普那霉素作用之后的15 20h内，细菌的生长繁殖仍表现出明显的受抑制状态。(2)临床应用普那霉素对很多种感染具有较好的疗效，如皮肤和软组织感染、传染性肺炎、医院获得性肺炎(作为联合治疗的一部分)、心内膜炎、菌血症及脓毒血症等。美国FDA专家小组推荐普那霉素用于皮肤及软组织感染治疗、医院获得性肺炎以及万古霉素耐药屎肠球菌 (VREF)感染的急重症病人。据统计，普那霉素对于万古霉素耐药VRE感染引发的菌血症病人的临床治疗有效率达70% ；而对MRSA引起的皮肤软组织感染、医院获得性肺炎、菌血症的临床有效率约为70% -75%。与万古霉素相似，普那霉素亦对严重骨关节感染有显著疗效。在以上所有应用普那霉素治疗的病例中很少出现治疗引起的耐药菌。普那霉素可作为万古霉素的替代药物，在治疗多重耐药革兰氏阳性菌引起的感染中发挥其应有的作用。2、普那霉素提取技术研究现状自从1964年罗纳-普朗克罗瑞公司就普那霉素的传统发酵生产方法申请了专利以来，普那霉素的研究开发工作一直未受到人们足够的重视。直到20世纪90年代，由于临床上MRSA、VRE以及多重耐药的“超级细菌”的出现，甚至连治疗多重耐药菌的最后一道防线-万古霉素都显得“捉襟见肘”时，普那霉素这类链阳性菌素类抗生素又开始重新受到人们的关注。但大部分研究工作集中在与普那霉素生物合成相关的酶及基因克隆、普那霉素水溶性衍生物的开发、抗菌活性及临床应用等方面，而在普那霉素发酵、提取等生产工艺方面的研究则明显不足。普那霉素关于分离纯化的研究报道较少。迄今为止，文献和专利中已经报道过的分离纯化方法主要包括有机溶剂萃取、双水相萃取和高速逆流色谱法。罗纳-普朗克罗瑞公司的专利最早报道了采用有机溶剂从发酵液中提取普那霉素的方法发酵液酸化处理后再经过二氯乙烷逆流离心提取、减压干燥、石油醚沉淀、干燥等纯化步骤后得到普那霉素成品，其中普那霉素的含量约为80%左右。liquet等用“葡聚糖-聚乙二醇(PEG) ”双水相系统从始旋链霉菌发酵液中萃取分离普那霉素，并以PEG与PEG脂肪酸酯混合液替代PEG相， 使分离效果得到了显著提高。Drogue等用“氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水”作为溶剂系统，对普那霉素粗品采用高速逆流色谱法纯化条件进行了初步的研究。研究表明，以氯仿乙酸乙酯甲醇水=2 2 3 2 (ν ν)作为溶剂系统，PIIA和PIIB组分的分离度能达到2. 21，但该溶剂系统对PIA和PIIB组分的选择性较差。考虑到PI组分的酸碱性质，他们又在上述溶剂系统中加入甲酸来调节PH值以增强其对PIA组分的选择性，研究发现以氯仿乙酸乙酯甲醇水甲酸=2.4 1.6 3 2 0.4(ν ν)作为溶剂系统，只需 30min即可分离PIA和PIIB组分，且二者的分离度也可接近2。表1文献中报道的普那霉素分离纯化方法的优缺点比较权利要求1.，其特征在于发酵液经吸附树脂洗脱、纳滤浓缩、溶媒结晶、浓缩、干燥后获得普那霉素成品。2.如权利要求1所述的，其特征在于吸附树脂洗脱具体工艺为将发酵液过筛分离，树脂用两倍体积的20%乙醇-80%的酸液洗涤后装柱，分别采用PH值4. 0的乙醇-酸液洗脱，分段收集洗脱液，合并高浓度洗脱液。3.如权利要求1所述的，其特征在于纳滤浓缩具体工艺为大孔吸附树脂洗脱液用等体积乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠脱水后， 进行纳滤浓缩。4.如权利要求1所述的，其特征在于溶媒结晶具体工艺为普那霉素浓缩液冷库静置12h，抽滤，得到普那霉素湿粉，干燥，得淡黄色普那霉素精粉。5.如权利要求2所述的，其特征在于发酵液过筛目数为 30-50 目。6.如权利要求2所述的，其特征在于吸附树脂可以为 SP207、XAD-16、JD-1。7.如权利要求2所述的，其特征在于装柱量为柱体积的 1/2-2/3。8.如权利要求2所述的，其特征在于乙醇-酸液洗脱浓度分别为40%乙醇-60%酸液和90%乙醇-10%酸液。9.如权利要求3所述的，其特征在于乙酸乙酯萃取次数为2-3次。10.如权利要求3所述的，其特征在于纳滤浓缩的操作参数为操作压强差为1. OMPa-1. 6MPa，循环流速为0. 18-0. 20m/s，操作温度为40°C左右。全文摘要本专利技术公开了，属于生物
该方法的主要步骤为吸附树脂洗脱、纳滤浓缩、溶媒结晶、浓缩干燥后获得普那霉素成品，经检测其纯度达到98％以上，产品收率高于68％。本专利技术采用上述分离纯化获得普那霉素，能耗低，设备结构简洁紧凑，方法易行，操作安全方便，易于实现自动化生产。文档编号C07K7/06GK102558302SQ20111041966公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日专利技术者王云娜 申请人:北京科朗宏达科技有限责任公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王云娜，
申请(专利权)人：北京科朗宏达科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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