本发明专利技术公开了一种基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，利用33K非结构蛋白抗体仅存在于I群禽腺病毒感染动物体内，来区分感染动物和灭活苗免疫动物，为消灭FAVI提供了一种有实际价值的诊断工具。应用本发明专利技术可建立识别I群禽腺病毒感染产生的抗体的方法，而与I群禽腺病毒灭活苗免疫的抗体无反应，具有较高的特异性与敏感性，可区分I群禽腺病毒感染动物与灭活苗免疫动物，消除被感染动物，对该病的防控与净化具有重要意义，该法操作简单，耗时短，成本低，可大批量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，尤其是一种基于33K蛋白的FAVI 抗体间接ELISA检测试剂盒及其应用。
技术介绍
I群禽腺病毒(f0Wl adenovirus group I，FAVI)归属于腺病毒科禽腺病毒属，具有共同的群抗原，包括传统的禽腺病毒及其他禽类分离物，共12个血清型，代表株为鸡胚致死孤儿(chicken embryo lethal orphan, CEL0)病毒。该病在鸡、鸭、鹅体内普遍存在， 能使鸡群呈隐性感染，作为继发病原共同作用于家禽，并能垂直传播，污染鸡胚，临床和病理症候群包括包涵体肝炎、再生障碍性贫血、轻度呼吸道疾病和产蛋下降。FAVI较多的是在体内复制而不发病，动物感染该病毒后，呈隐性感染，与其他病原共同作用于家禽。目前，检测FAVI的血清学方法主要有琼脂免疫扩散、中和试验、免疫荧光、对流免疫电泳、间接血凝反应和Southern杂交等。这些方法耗时、费力，不适合大批量的检测血清样品，而且使用的抗原较多为全病毒，存在散毒的危险。同时，FAVI的灭活苗免疫后，动物体内也会产生蛋白抗体，如何区分FAVI免疫动物和感染动物对防控、净化和消灭该病具有至关重要的作用，然而，目前缺乏区分FAVI免疫动物和感染动物的间接ELISA方法。目前在疫病防制中采用的灭活疫苗，在制备过程中破坏了绝大多数非结构蛋白， 因此用灭活苗免疫动物，理论上动物体内就只有结构蛋白抗体而极少有甚至用现有方法检测不到的非结构蛋白抗体。而动物感染野毒后，病毒在体内复制、增殖的过程中就有非结构蛋白的表达，因此理论上可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分野毒感染动物和灭活苗免疫动物。大量研究表明，利用病毒非结构蛋白建立的ELISA方法能区分野毒感染与灭活苗免疫产生的抗体，Raue R等利用牛病毒性腹泻NS基因建立商品化ELISA试剂盒，以区分野毒感染和灭活苗免疫产生的抗体。我国台湾学者Sm PY等利用乙型脑炎非结构蛋白 NSl建立区分感染和免疫抗体的间接ELISA方法。Bruderer U等利用重组蛋白3ABC建立区分口蹄疫自然感染和疫苗免疫的抗体的ELISA方法。Makkay AM等利用新城疫NP基因建立区分自然感染和HN基因亚单位疫苗鸡抗体的ELISA方法。Laviada MD等构建非洲马病 NS3基因重组菌，区分自然感染和灭活苗免疫的方法。31蛋白是由腺病毒晚期L4区编码的一个非结构蛋白。31蛋白参与衣壳的形成过程，为空壳病毒粒子的组成成分，但当病毒DNA进入衣壳时，3 蛋白开始被蛋白酶水解。 人和动物腺病毒的3 基因较多由2个外显子组成，内含子大小各异。31作为腺病毒编码 RNA的剪接因子，优先激活弱的3’剪接位点序列的转录物剪接。此外，IIIa蛋白是病毒传染相关的剪接增强子，33K通过IIIa充分激活腺病毒的剪切，启动蛋白质装配。因而，3K蛋白在腺病毒感染过程中的重要性日益引起关注。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、准确、简便、适于大批量检测的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，以便于I群禽腺病毒感染的诊断，同时，能够区分I群禽腺病毒感染产生的抗体与灭活苗免疫产生的抗体。为解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案基于33K蛋白的FAVI抗体间接 ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性血清、灭活苗免疫的阳性血清、感染的阳性血清、 羊抗鸡IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以I群禽腺病毒3 重组蛋白作为包被抗原。I群禽腺病毒31重组蛋白由序列表SEQ. ID. No. 1的31基因片段编码。I群禽腺病毒31重组蛋白由基因工程菌株大肠杆菌DH5 α体外诱导表达获得，该菌株含表达质粒PGEX-33K。I群禽腺病毒3 重组蛋白的制备是以I群禽腺病毒代表株鸡胚致死孤儿病毒基因组为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后于PGEX-4T-1表达载体连接， 构建原核表达载体PGEX-33K，将阳性重组菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中进行IPTG 诱导表达，收集大量表达的重组宿主并超声裂解，用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析纯化得到目的蛋白；特异性引物为上游引物 CCGGAATTCTCTCTCCCTCATTTCT (序列表 SEQ. ID. No. 2)，下游引物CCGCTCGAGCTTGATAGCATCGCTCTTC (序列表 SEQ. ID. No. 3)。包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至1 20 μ g/mL，加入96孔酶标板， 100 μ L/孔，置于37°C温育Ih后，4°C过夜；用PBST洗板3次，拍干；用封闭液封闭酶标板， 200uL/孔，37°C孵育，封闭lh，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为5%脱脂奶；包被液为 PH 9. 6的碳酸盐缓冲液。羊抗鸡IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。阴性血清是以SPF鸡胚孵育所产2 5日龄雏鸡的血清；灭活苗免疫的阳性血清是经I群禽腺病毒灭活苗两次皮下免疫后的SPF鸡血清；感染的阳性血清是经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF 鸡血清；洗涤液是含有0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液，PH为7. 4 ；稀释液是BSA;底物液是TMB-H2A溶液；终止液是2M H2SO4。磷酸盐缓冲液由NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g, KH2PO4 0. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，吐温-20 500uL，加蒸馏水定容至1000mL3M PH值到7. 4制成；TMB-H2A溶液由TMB缓冲液10ml、TMB 溶液 0. 5ml、H2O2 32ul 组成；TMB 缓冲液由 Na2HPO4 18. 27g，柠檬酸 4. 665g，用 900mL 溶解， 调PH至5. 5，加水至IOOOmL制成；TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB IOmg制成。基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒在区分I群禽腺病毒感染产生的抗体与灭活苗免疫产生的抗体中的应用。基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒在检测I群禽腺病毒感染的动物血清中31蛋白抗体的应用。本专利技术的基本原理是病毒非结构蛋白只在病毒复制增殖过程中表达，刺激机体产生非结构蛋白抗体，可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分野毒感染动物和灭活苗免疫动物。33K非结构蛋白在腺病毒感染中发挥重要作用，因而，本专利技术选取FAVI代表株的 31非结构蛋白，通过克隆表达，以原核表达的31重组蛋白作为鉴别诊断抗原，采用间接 ELISA模式，研制出FAVI非结构蛋白抗体检测试剂盒，为消灭FAVI提供了一种有实际价值的诊断工具。应用本专利技术可建立识别I群禽腺病毒感染产生的抗体的方法，而与I群禽腺病毒灭活苗免疫的抗体无反应，具有较高的特异性与敏感性，可区分I群禽腺病毒感染动物与灭活苗免疫动物，消除被感染动物，对该病的防控与净化具有重要意义，该法操作简单， 耗时短，成本低，可大批量检测。附图说明图1是pGEX_3;3K重组质粒酶切鉴定电泳图，图中M是DNA分子量标准，1_3是 PGEX-33K重组质粒双酶切产物。图2是pGEX_3;3K重组质粒在大肠杆菌中的表达图，图中M是蛋白质分子量标准,本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，罗思思，刘加波，谢丽基，庞耀珊，邓显文，谢志勤，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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