本发明专利技术公开了一种小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法。其步骤包括细胞分离、培养和纯化三个阶段，特别是在分离过程不中断营养的供给，改进了三次换液时间和洗涤方法，以及使用差速消化法提高细胞纯度。本发明专利技术能够从小鼠的脂肪组织中分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，为后期对脂肪干细胞进一步的研究奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物干细胞的分离方法，尤其涉及一种小鼠脂肪干细胞分离、培养及纯化的方法。脂肪干细胞具有多向分化的潜能，在体外可定向分化为脂肪、成骨、软骨、肝脏、心肌细胞等，在人源方面，相比于骨髓干细胞，其具有取材容易、获取量大、减少供体取材时痛苦的优点，因此在再生医学上具有重要的意义。小鼠作为一个重要的模式动物，在基础研究方面有着广泛的应用，但是小鼠脂肪干细胞的体外培养却一直是个难题，涉及所用的消化液、培养液等各个方面，以及所采取的分离方法与培养方法。对于现有资料的方法，纷繁芜杂，经实际操作后发现效果并不是十分的理想，其不足之处在于可操作性不强，有需要改进的地方。为此本专利技术针对实践过程中出现的一些问题，在相关环节上做了一些改进，经过多次尝试，形成了一个相对较完善，可操作性强的小鼠脂肪干细胞的消化分离体系和分离后细胞的培养方法。本专利技术要解决的技术问题是提供一种小鼠脂肪干细胞分离、培养及纯化的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种小鼠脂肪干细胞的分离、 培养及纯化方法，包括以下步骤一、细胞的分离(1)取材取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；(2)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入含青霉素和链霉素的DPBS液中洗净血污；(3)去除脂肪组织中的血管，再次洗涤，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液(10% FBS, 0. 09%胶原酶I，其余成分为DMEM/F12)，用连接有Iml吸嘴的移液器充分吹打，直至组织能够很通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中；记录加入消化液的量和最终悬液的体积，以计算脂肪组织的量，并使最终消化液的体积是脂肪组织的2-3倍；(4) 37°C消化lh，定期摇动，使组织块与消化液充分接触；(5)消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液；(6)低速离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打至少lmin，再次离心；(7)弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；(8)将细胞悬液用尼龙滤网过滤，所得滤液再次过滤，除去大部分成熟脂肪细胞， 收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上细胞的残留；(9)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；二、细胞培养(10)最后一次离心后用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规条件(37°C，5% CO2,100%湿度)培养；(11)每0. 4-0. 6ml的脂肪组织分离得到的细胞接种到六孔板的一孔中；(12)首次换液原代接种池后加入DPBS，反复洗涤5_6次，洗去大部分杂细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；(13)第二次换液首次换液24h后对其进行第二次洗涤，进一步洗去未贴壁细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；(14)第三次换液首次换液后7 后进行第三次洗涤，直至细胞面基本干净，加入新鲜的完全培养基继续培养；后期每3天半量换液一次，长至90%满即传代；三、纯化(15)细胞长满后，加入胰酶消化aiiin，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去；利用此方法多次传代，逐渐降低杂细胞的比例，从而达到纯化的目的。作为优选，步骤(2)所述青霉素的浓度为400IU/ml ；所述链霉素的浓度为400 μ g/ ml ο作为优选，从步骤( 切取出脂肪组织至步骤(10)最后一次离心后用完全培养基重悬并接种，整个过程时间控制在4h以内。作为优选，步骤(8)中，先用孔径为250 μ m的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80 μ m的尼龙滤网过滤。作为优选，完全培养基的组成成分为胎牛血清20%，青霉素100IU/ml，链霉素 100yg/ml, L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子lOng/ml，维生素C 50yg/ml, DMEM/F12 补足到 100%。作为优选，基础培养基的组成成分为胎牛血清20%，青霉素100IU/ml，链霉素 100 μ g/ml, L-谷氨酰胺 2mmol/L，DMEM/F12 补足到 100%。相比现有技术，本专利技术主要在以下三方面做出了改进一、在整个分离过程中不中断营养的供给在现有的一些分离程序中有的在消化过程中或洗涤过程中即中断了营养供给，由于整个分离程序所需时间漫长，这种做法可能不利于后期细胞活性的维持，为此，我们在整个分离程序中都给细胞提供营养，消化液中含细胞生长的基础成分，细胞洗涤也用培养基洗涤而非有关文献中报道的DPBS，最大程度的保持细胞的活性。二、洗涤换液程序原代培养的脂肪干细胞中存在着大量的血细胞和未消化的组织，尤其是后者漂浮在液体表面难以去除，血细胞若一直存在随后裂解，产生的有害物质会影响细胞的生长活性；换液过早，细胞尚未完全贴壁，不仅影响脂肪干细胞的获得率，同时也会对其造成严重的机械损伤；换液过迟，血细胞裂解后的不利影响将会体现出来，同时一些未消化的组织块也会贴壁并爬出细胞，从而影响细胞的纯度，因此首次换液洗涤换液时间的准确把握显得至关重要。然而首次换液和第二次换液均考虑到机械损伤的问题，不能过度洗涤，所以两次洗涤后还会残留一部分杂细胞和组织，可待细胞充分贴壁后对其进行第三次洗涤，直至细胞面没有明显的杂质再加入新鲜的完全培养基继续培养。通过在合适的时间对其进行上述的洗涤换液程序，逐步降低杂细胞的比例，同时减少了对脂肪干细胞的机械损伤，从而更好的维持小鼠脂肪干细胞生长活性；3次洗涤换液后杂细胞与组织已基本去除，以利于后期的长期培养直至细胞长满传代。三、细胞的纯化脂肪组织中存在多种细胞，有上皮细胞、成熟脂肪细胞、脂肪母细胞、血细胞等各种细胞，尤其是内皮细胞，主要来源于血管壁，在分离程序中有剔除血管的操作可减少杂细胞的引入。但是无论如何操作都会或多或少有杂细胞进入培养体系，为此， 我们在了解了脂肪干细胞和杂细胞的生物学特性后，主要根据二者传代时所需的胰酶消化时间的差异，摸索出了一个合适的消化时间，利用差速消化法将杂细胞和脂肪干细胞分开， 多次传代最终得到高纯度的脂肪干细胞。实践证明，通过此方法分离培养出的细胞能够很好的维持脂肪干细胞的相关特性，同时获得的脂肪干细胞纯度很高。本专利技术的有益效果是能够从小鼠的脂肪组织中分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，为后期对脂肪干细胞的进一步研究奠定了基础。(一 )细胞的分离1.取材取4周龄的ICR雄鼠，颈椎脱臼处死，75%酒精全身浸泡消毒5min ；有报道显示供体的年龄对脂肪干细胞后期的分化潜能有着重要的影响，为此我们选择此周龄的小鼠。实践证明此阶段小鼠分离得到的脂肪干细胞能很好的用于后期的分化研究。2. 75%酒精消毒腹部，低位横向切口打开腹腔，在无菌条件下迅速切取腹股沟处的脂肪组织，在取脂肪组织时要注意辨别并弃去淋巴结，以免影响后期细胞的纯度。放入含双抗(400IU/ml青霉素、400 μ g/ml链霉素)的DPBS中洗3遍。3.手术刀和镊子配合使用，清除脂肪组织中的血管。具体操作步骤如下(1)将浸泡于DPBS中的脂肪组织先在皿底吸附片刻，去除表面的液体，以方便后期脂肪组织能够牢固的贴在皿底，便于下一步的操作。(2)将充分去除DPBS的脂肪组织转移到一个新的皿中，尽量铺展开，暴露出血管的纹路，并将其本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，包括以下步骤一、细胞的分离(1)取材取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；(2)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入含青霉素和链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗净血污；(3)去除脂肪组织中的血管，再次洗涤，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，消化液的组成成分为10%胎牛血清(FBS)，0. 09%胶原酶I，余量为DMEM/F12 ；用连接有 Iml吸嘴的移液器充分吹打，直至组织能够很通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中； 记录加入消化液的量和最终悬液的体积，以计算脂肪组织的量，并使最终消化液的体积是脂肪组织的2-3倍；(4)37°C消化lh，定时摇动，使组织块与消化液充分接触；(5)消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液；(6)1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打至少lmin，再次离心；(7)弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；(8)将细胞悬液先用孔径为250μ m的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为 80 μ m的尼龙滤网过滤，除去大部分成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上细胞的残留；(9)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；二、细胞培养(10)最后一次离心后用完全培养基重悬，接种，置于培养箱常规条件培养；(11)每0.4-0. 6ml左右的脂肪组织分离得到的细胞接种到六孔板的一孔中；(12)首次换液原代接种池后加入弃去培养基，用DPBS反复洗涤5-6次，洗去大部分杂细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；(13)第二次换液首次换液24...
【专利技术属性】
技术研发人员：张运海，魏超，刘星，李运生，张宇，陈建文，章孝荣，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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